Cell seeding of porous polymer-based scaffolds with human adipose-derived stem cells

Abstract

Kudosteknologia pyrkii korjaamaan tai luomaan uusia kudoksia ja elimiä vaurioituneiden tilalle. Se hyödyntää biohajoavia tukirakenteita (skaffoldeja), soluja ja kasvutekijöitä yksinään tai yhdessä. Eräs lupaava kudosteknologian menetelmä alkaa solunsyötöllä, jossa huokoiseen skaffoldiin istutetaan soluja ja rakennetta kasvatetaan in vitro ennen sen implantoimista vaurioalueelle. Solunsyötön pitäisi johtaa tasaiseen solujakaumaan skaffoldin sisällä - muuten rakennetun kudoksen toiminnollisuus ja mekaaniset ominaisuudet saattavat jäädä odotettua huonommiksi. Jotta arvokkaita soluja ei hukattaisi, solunsyöttöprosessin tulisi olla myös tehokas. Tämä edesauttaa myös nopeampaa kudoksen muodostumista.

Työssä testattiin kuutta erilaista solunsyöttömenetelmää tarkoituksena optimoida syöttömenetelmä kahdelle ylikriittisellä hiilidioksidilla prosessoidulle skaffoldityypille. Näistä toinen oli poly(L-laktidi-ko-ε-kaprolaktoni) 70/30 (PLCL) -kopolymeeristä valmistettu ja toinen PLCL:n sekä β-trikalsiumfosfaattikeraamin komposiitti. Solunsyöttömenetelmien toimivuus varmistettiin kahdella poly-L/D-laktidi 96L/4D (PLDLA 96/4) kuiduista valmistetulla skaffoldityypillä. Lisäksi tutkittiin uudenlaista solunsyöttömallia, joka pohjautuu rautaa sisältäviin mikropartikkeleihin. Mallissa soluja jäljiteltiin halkaisijaltaan 15 µm ja 100 µm kokoisilla partikkeleilla. Aikuisen rasvan kantasoluja käytettiin solukokeissa, koska niillä on valtava potentiaali ruston ja luun kudosteknologiassa.

Tutkimuksissa mikropartikkelisolunsyöttömallin huomattiin toimivan ja tarjoavan hyödyllistä tietoa skaffoldien rakenteesta ja sen soveltuvuudesta solujen istutukseen. Rautapartikkelien jakaumat vaikuttivat tosin tasaisemmilta kuin vastaavien solunsyöttökokeiden tulokset. Solunsyöttömalli osoitti myös komposiittiskaffoldien rakenteen olevan solunsyötön suhteen haasteellisempi kuin vastaavien PLCL skaffoldien. Mikro-CT kerroskuvauksen avulla pystyttiin havaitsemaan myös nanokokoluokan rautaoksidipartikkeleilla leimattujen solujen sijainti skaffoldien sisällä. Tämän perusteella huomattiin, että tavallisella ruiskulla voitiin pakottaa solususpensiota PLCL skaffoldien sisään ja parantaa siten solujen tasaista jakautumista verrattuna muihin menetelmiin.

Johtuen teknologisista rajoitteista solunsyötön onnistumisen arviointi komposiittiskaffoldeissa oli haasteellista. Solunsyöttöä rautapartikkeleilla mallinnettaessa huomattiin niiden rakenteen olevan kuitenkin hieman vaikeampi solujen istutusta ajatellen. Perinteinen staattinen solujen pipetointi skaffoldin pinnalle oli riittävä PLDLA kuituskaffoldeissa, tuottaen tasaisen solujakauman ja tyydyttävän solumäärän skaffoldeissa.

Tissue engineering aims to regenerate or create damaged or lost organs and tissues by utilizing biodegradable scaffolds, cells and growth factors. One promising tissue engineering strategy involves seeding cells into a porous scaffold and culturing it in vitro, which is followed by implantation into the defect site. Cell seeding should result in a uniform distribution of cells inside the scaffold - otherwise the functionality and mechanical properties of the engineered construct can be compromised. Also a high seeding efficiency is appreciated to avoid wasting valuable cells and to enable faster tissue formation.

The aim of this study was to test six different cell seeding methods in order to find an optimal method for supercritical carbon dioxide (ScCO2) processed scaffolds. Of these scaffolds, one was a copolymeric poly(L-lactide-co-ε-caprolactone) 70/30 (PLCL) scaffold, whereas the other one was a composite of PLCL and β-tricalcium phosphate. The functionality of the cell seeding methods was verified with two scaffold types that were manufactured from poly-L/D-lactide 96L/4D (PLDLA 96/4) fibers. In addition, a novel cell seeding model utilizing iron-labeled microspheres with diameters of 15 µm and 100 µm was proposed. Adipose-derived stem cells (ASC) were used in the experiments due to their potential in hard-tissue engineering.

The study revealed that the microsphere seeding model is functional, offering useful information about the seedability of the ScCO2 processed scaffolds. The microsphere distributions were noticed to be more uniform compared to the corresponding cell seeding results. The microsphere model also suggested more challenging seedability of the composite scaffolds compared to the PLCL substrates. Applying micro-computed tomography (micro-CT) imaging and seeding ASCs fed with iron oxide nanoparticles, it was noted that the uniformity of the cell distribution in ScCO2 processed PLCL scaffolds can be enhanced by forcing the cell suspension into the scaffold with a syringe.

Due to technological limitations, evaluating cell seeding in the composite scaffolds was more challenging. However, the cell experiments supported the microsphere model, indicating a more difficult seedability compared to the PLCL scaffolds. A static pipetting of cells on top of the PLDLA fabrics was enough to provide desirable cell distribution and cell numbers in those scaffold types.