Evaluation of the pluripotency of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) reprogrammed with integrative and non-integrative protocols and their differentiation into cardiomyocytes
Elo, Tanja (2014)
2014
Biokemia - Biochemistry
BioMediTech - BioMediTech
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2014-05-26
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201407041958
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201407041958
Tiivistelmä
Research background and aims: The purpose of this research was to evaluate the pluripotency of integrative retro and non-integrative Sendai virally generated human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and their cardiac differentiation efficiency, giving value on gene activity analysis of exogenous pluripotency factors. These exogenes have been hypothesized to be reactivated in higher passages of iPSCs generated with integrative methods, resulting in low differentiation efficiency.
Materials and methods: hiPSCs reprogrammed with Sendai and retro virus were cultivated by co-culture of MEF cells and characterized for their pluripotency by RT-PCR analysis for exogenous and endogenous pluripotency markers, immunocytochemistry for pluripotency markers and embryoid body (EB) formation with sequential RT-PCR analysis for germ layer markers. These characterized hiPSCs were differentiated into cardiomyocytes by co-culturing with END-2 cells. Exogenous pluripotency gene activity was studied by RT-PCR analysis after cardiac differentiation as well. Cardiomyocytes were characterized also by immunocytochemistry for cardiac markers. The cardiac differentiation efficiency was evaluated between Sendai and retro virally induced hiPSC lines.
Results: The pluripotency of all hiPSC lines was confirmed, except one retro virally induced line (R-00208) was expressing exogenous pluripotency gene Oct-3/4. Cardiac differentiation showed variable morphology, size and number of the beating areas between cell lines. Retro virally induced lines differentiated more efficiently into cardiomyocytes than Sendai virally induced lines. Exogene Oct-3/4 stayed active in R-00208 even after cardiac differentiation. This line was the most efficient to differentiate into cardiomyocytes. Thus differentiation didn t switch off exogenous Oct-3/4 expression.
Conclusions: Traces of exogenous pluripotency activity was hypothesized to impair the cardiac differentiation but this study suggests that exogenous Oct-3/4 might actually enhance cardiac differentiation. Several differentiation experiments with different iPSC lines in many passages are required in order to determine the effect of transgene activity in differentiation. The mechanism behind the dualistic role of Oct-3/4 in pluripotency maintenance and lineage commitment is another problem to be solved.
Integroituvalla ja ei-integroituvalla menetelmällä uudelleenohjelmoitujen ihmisen indusoitujen pluripotenttien kantasolujen (hiPSCs) pluripotenttisuuden ja sydänlihassoluiksi erilaistamisen arviointi
Tutkielman tausta ja tavoitteet: Tutkimuksen tarkoitus oli arvioida integroituvalla retroviruksella ja ei-integroituvalla Sendai-viruksella uudelleenohjelmoitujen ihmisen indusoitujen pluripotenttien kantasolujen (hiPSCs) pluripotenttisuutta ja sydänlihassoluiksi erilaistamista. Eksogeenisten pluripotenttimarkkereiden geeni-ilmentymisen analyysi oli tärkeä osa tutkimusta. Eksogeenisten markkerigeenien on arveltu voivan uudelleenaktivoitua pitkään kasvatetuissa integroituvilla menetelmillä valmistetuissa hiPS-soluissa, mikä saattaa aiheuttaa matalan erilaistustehokkuuden.
Tutkimusmenetelmät: hiPS-soluja viljeltiin yhteiskasvatuksessa MEF-solujen kanssa. hiPS-solujen pluripotenttisuuden määrityksiin sisältyi eksogeenisten ja endogeenisten pluripotenttimarkkereiden geeniaktiivisuuden tutkiminen RT-PCR-menetelmällä, pluripotenttimarkkereiden immunosytokemia sekä embryoid body (EB) -aggregaattien muodostuminen ja alkiokerrosmarkkereiden RT-PCR. Karakterisoidut hiPS-solut erilaistettiin sydänlihassoluiksi viljelemällä niitä END-2 solujen kanssa yhteiskasvatuksessa. Eksogeenisten pluripotenttimarkkereiden geeniaktiivisuus tutkittiin RT-PCR-menetelmällä myös sydänerilaistuksen jälkeen. Sydänlihassolujen karakterisointiin kuului myös sydänmarkkereiden immunosytokemia. Sendai- ja retroviraalisesti ohjelmoitujen hiPSC-linjojen sydänerilaistusta arvioitiin ja verrattiin keskenään.
Tutkimustulokset: Kaikki hiPS-solulinjat todettiin pluripotenteiksi. Toisessa retroviraalisesti ohjelmoidussa linjassa (R-00208) eksogeenisen pluripotenttigeenin Oct-3/4 havaittiin olevan aktiivinen. Sydänerilaistuksessa havaittiin eroja sykkivien alueiden morfologiassa, koossa ja lukumäärässä eri linjojen välillä. Retroviruksella ohjelmoidut linjat erilaistuivat tehokkaammin kuin Sendai-viruksella johdetut linjat. Eksogeeninen Oct-3/4 pysyi aktiivisena sydänerilaistuksen jälkeenkin linjassa R-00208. Kyseinen linja erilaistui sydänlihassoluiksi kaikkein tehokkaimmin. Sydänerilaistus ei siten hiljentänyt eksogeenista Oct-3/4 aktiivisuutta.
Johtopäätökset: Eksogeenisen pluripotenttimarkkeriaktiivisuuden ajateltiin heikentävän sydänerilaistustehokkuutta, mutta tämän tutkimuksen perusteella eksogeenisen Oct-3/4 -markkerin ilmentyminen saattaa jopa parantaa sydänerilaistusta. Uusia erilaistuskertoja useammilla iPSC-linjoilla eri kasvatusnumeroilla kuitenkin tarvitaan transgeenien vaikutuksen arvioimiseksi erilaistuksessa. Myös Oct-3/4 -markkerin kaksijakoinen rooli pluripotenttisuuden ylläpitämisessä ja erilaistussuunnan määrityksessä vaatii lisätutkimuksia.
Materials and methods: hiPSCs reprogrammed with Sendai and retro virus were cultivated by co-culture of MEF cells and characterized for their pluripotency by RT-PCR analysis for exogenous and endogenous pluripotency markers, immunocytochemistry for pluripotency markers and embryoid body (EB) formation with sequential RT-PCR analysis for germ layer markers. These characterized hiPSCs were differentiated into cardiomyocytes by co-culturing with END-2 cells. Exogenous pluripotency gene activity was studied by RT-PCR analysis after cardiac differentiation as well. Cardiomyocytes were characterized also by immunocytochemistry for cardiac markers. The cardiac differentiation efficiency was evaluated between Sendai and retro virally induced hiPSC lines.
Results: The pluripotency of all hiPSC lines was confirmed, except one retro virally induced line (R-00208) was expressing exogenous pluripotency gene Oct-3/4. Cardiac differentiation showed variable morphology, size and number of the beating areas between cell lines. Retro virally induced lines differentiated more efficiently into cardiomyocytes than Sendai virally induced lines. Exogene Oct-3/4 stayed active in R-00208 even after cardiac differentiation. This line was the most efficient to differentiate into cardiomyocytes. Thus differentiation didn t switch off exogenous Oct-3/4 expression.
Conclusions: Traces of exogenous pluripotency activity was hypothesized to impair the cardiac differentiation but this study suggests that exogenous Oct-3/4 might actually enhance cardiac differentiation. Several differentiation experiments with different iPSC lines in many passages are required in order to determine the effect of transgene activity in differentiation. The mechanism behind the dualistic role of Oct-3/4 in pluripotency maintenance and lineage commitment is another problem to be solved.
Integroituvalla ja ei-integroituvalla menetelmällä uudelleenohjelmoitujen ihmisen indusoitujen pluripotenttien kantasolujen (hiPSCs) pluripotenttisuuden ja sydänlihassoluiksi erilaistamisen arviointi
Tutkielman tausta ja tavoitteet: Tutkimuksen tarkoitus oli arvioida integroituvalla retroviruksella ja ei-integroituvalla Sendai-viruksella uudelleenohjelmoitujen ihmisen indusoitujen pluripotenttien kantasolujen (hiPSCs) pluripotenttisuutta ja sydänlihassoluiksi erilaistamista. Eksogeenisten pluripotenttimarkkereiden geeni-ilmentymisen analyysi oli tärkeä osa tutkimusta. Eksogeenisten markkerigeenien on arveltu voivan uudelleenaktivoitua pitkään kasvatetuissa integroituvilla menetelmillä valmistetuissa hiPS-soluissa, mikä saattaa aiheuttaa matalan erilaistustehokkuuden.
Tutkimusmenetelmät: hiPS-soluja viljeltiin yhteiskasvatuksessa MEF-solujen kanssa. hiPS-solujen pluripotenttisuuden määrityksiin sisältyi eksogeenisten ja endogeenisten pluripotenttimarkkereiden geeniaktiivisuuden tutkiminen RT-PCR-menetelmällä, pluripotenttimarkkereiden immunosytokemia sekä embryoid body (EB) -aggregaattien muodostuminen ja alkiokerrosmarkkereiden RT-PCR. Karakterisoidut hiPS-solut erilaistettiin sydänlihassoluiksi viljelemällä niitä END-2 solujen kanssa yhteiskasvatuksessa. Eksogeenisten pluripotenttimarkkereiden geeniaktiivisuus tutkittiin RT-PCR-menetelmällä myös sydänerilaistuksen jälkeen. Sydänlihassolujen karakterisointiin kuului myös sydänmarkkereiden immunosytokemia. Sendai- ja retroviraalisesti ohjelmoitujen hiPSC-linjojen sydänerilaistusta arvioitiin ja verrattiin keskenään.
Tutkimustulokset: Kaikki hiPS-solulinjat todettiin pluripotenteiksi. Toisessa retroviraalisesti ohjelmoidussa linjassa (R-00208) eksogeenisen pluripotenttigeenin Oct-3/4 havaittiin olevan aktiivinen. Sydänerilaistuksessa havaittiin eroja sykkivien alueiden morfologiassa, koossa ja lukumäärässä eri linjojen välillä. Retroviruksella ohjelmoidut linjat erilaistuivat tehokkaammin kuin Sendai-viruksella johdetut linjat. Eksogeeninen Oct-3/4 pysyi aktiivisena sydänerilaistuksen jälkeenkin linjassa R-00208. Kyseinen linja erilaistui sydänlihassoluiksi kaikkein tehokkaimmin. Sydänerilaistus ei siten hiljentänyt eksogeenista Oct-3/4 aktiivisuutta.
Johtopäätökset: Eksogeenisen pluripotenttimarkkeriaktiivisuuden ajateltiin heikentävän sydänerilaistustehokkuutta, mutta tämän tutkimuksen perusteella eksogeenisen Oct-3/4 -markkerin ilmentyminen saattaa jopa parantaa sydänerilaistusta. Uusia erilaistuskertoja useammilla iPSC-linjoilla eri kasvatusnumeroilla kuitenkin tarvitaan transgeenien vaikutuksen arvioimiseksi erilaistuksessa. Myös Oct-3/4 -markkerin kaksijakoinen rooli pluripotenttisuuden ylläpitämisessä ja erilaistussuunnan määrityksessä vaatii lisätutkimuksia.