Light-induced biomaterial microfabrication for advanced cell culturing – a comparative study

Abstract

The integration of microfluidics, microfabrication technologies and biomaterials has established new means to mimic the natural microenvironment of cells. Using microfluidic culture devices, cells can be stimulated with both mechanical and chemical cues. Light, in the form of UV lamps and lasers, is a powerful microfabrication tool for biomedical applications, offering high resolution and fast production. Special photocurable materials have been developed to meet the needs of this technology. The first part of this thesis is a literature review on this research field, focusing especially on microfabrication using lasers and photosensitive hydrogels in cell-based applications. Recently, photopolymerization by non-linear light absorption has been introduced to microfabrication, breaking the resolution boundaries set by classical optics. This phenomenon is utilized in two-photon polymerization (2PP), a method for the rapid freeform fabrication of 3D micro- and nanostructures. The basic theory of 2PP is provided in the literature review. Unfortunately, 2PP has mainly been studied with common photoresists and investigation of suitable synthetic biomaterials for the biomedical applications of 2PP has remained insufficient. The latter part of this thesis presents an innovative and scientifically original study that aims to widen the selection of 2PP processable biomaterials. In the experiments, 2PP was investigated with a commercial photoinitiator (PI) and two biomaterials: a novel polycaprolactone-based oligomer (PCL-o) and a poly(ethylene glycol) hydrogel (PEGda). PCL-o is a novel photopolymer synthesized for research purposes and has never been used in 2PP; moreover, 2PP of PEGda with the laser type used has not been reported previously. In the study, the two materials were compared in terms of resolution and overall 2PP processability. Using a custom-built fabrication setup based on an affordable Nd:YAG laser, arbitrary microstructures were polymerized on glass substrates and subsequently characterized using SEM imaging. Additionally, the effect of PI concentration on resolution was investigated. Cytotoxicity of the sample materials was tested in order to estimate the applicability of the fabricated microstructures in cell-based applications. The outcome of this study was a success, since 2PP of both PEGda and PCL-o was successfully demonstrated and the Nd:YAG laser proved adequate for the research of novel biomaterial microstructures; resolution in the order of one micrometer was achieved with PCL-o. Based on the cytotoxicity tests, both PEGda and PCL-o were found non-cytotoxic and suitable e.g. for use in guided cell growth. Despite some differences in the fabrication process, the processability of PEGda and PCL-o was found equally well suited for 2PP and research with these materials should definitely be continued in the future. The versatility of the current fabrication system could be improved by experimenting different new photocrosslinkable oligomers, more efficient PIs, optimized equipment, sterilization of the microstructures and cell culturing. /Kir10

Biomateriaalien mikrovalmistusmenetelmien kehittymisen myötä voidaan valmistaa yhä paremmin solujen luonnollista mikroympäristöä mimikoivia kasvatusalustoja, joissa soluja stimuloidaan sekä mekaanisin että kemiallisin signaalein mikrofluidistiikan avulla. UV-lamppuja ja lasereita hyödyntävä valoavusteinen mikrovalmistus on yksi kehittyneimmistä menetelmistä tällaisiin sovelluskohteisiin ja menetelmää varten on kehitetty myös uusia valokovettuvia biomateriaaleja. Tämän diplomityön ensimmäinen osa on laaja kirjallisuusselvitys, joka käsittelee mikrofluidistiikan, valoavusteisen mikrovalmistuksen ja biomateriaalien hyödyntämistä soluviljelysovelluksissa. Työssä syvennytään lasermikrovalmistukseen ja valosillottuvien hydrogeelien mikrokuvioitiin. Uusi trendi mikrovalmistuksessa on valon epälineaariseen absorptioon perustuvat menetelmät, joissa päästään nanometriluokan resoluutioon. Yksi niistä on kaksifotonipolymeraatio (2PP), 3D-mikrovalmistukseen sopiva pikamallinnusmenetelmä, jolla voidaan valmistaa mielivaltaisia mikro- ja nanokuvioita. Menetelmän teorian pääpiirteet esitellään kirjallisuusselvityksessä. Biosovelluksissa 2PP:n suurin rajoite on se, että pääsääntöisesti menetelmää on tutkittu perinteisillä fotoresisteillä ja bioyhteensopivien synteettisten materiaalien tutkimus on ollut puutteellista. Tässä työssä tehdyn tieteellisen tutkimuksen tarkoitus oli kokeilla ja esitellä 2PP:oon sopivia biomateriaaleja, joista voidaan valmistaa soluyhteensopivia mikrorakenteita. 2PP-menetelmää tutkittiin polyetyleeniglykolihydrogeelillä (PEGda) sekä uudella polykaprolaktonipohjaisella oligomeerilla (PCL-o) käyttäen kaupallista fotoinitiaattoria. PCL-o on synteettinen biohajoava polymeerimateriaali, jota ei ole ennen testattu 2PP:ssa; myöskään PEGda:n 2PP-valmistusta käytetyllä lasertyypillä ei ole aiemmin raportoitu. Tutkimuksessa vertailtiin PEGda:n ja PCL-o:n sopivuutta 2PP-valmistukseen resoluutio ja prosessoitavuus huomioon ottaen. Itsekoottua Nd:YAG-laseriin perustuvaa tietokoneohjattua laitteistoa käyttäen lasialustalle polymeroitiin mikrokuvioita, jotka karakterisoitiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla. Työssä tutkittiin myös initiaattorikonsentraation vaikutus resoluutioon. Näytemateriaaleille tehtiin sytotoksisuuskokeet, joiden avulla arvioitiin valmistettujen mikrorakenteiden sopivuus biosovelluksiin. Onnistuneeksi osoittautuneen tutkimuksen mukaan sekä PEGda:n että PCL-o:n prosessoitavuus 2PP:ssa oli riittävä ja käytetty laserlaitteisto soveltui tarkoitukseen hyvin; PCL-o:lla saatiin jopa 1 µm:n resoluutio. Sytotoksisuustestien perusteella molemmat materiaalit ovat ei-toksisia ja siten soveltuvat erilaisiin soluviljelysovelluksiin. Vaikka materiaalien välillä ilmeni valmistusprosessissa joitakin eroja, tämän tutkimuksen perusteella molempien materiaalien testaamista 2PP:ssa tulee ehdottomasti jatkaa. Tulevaisuudessa menetelmän käytettävyyttä voisi parantaa mm. testaamalla useampia uusia materiaaleja, tehokkaampia fotoinitiaattoreita, optisesti laadukkaampaa laitteistoa, mik-rorakenteiden sterilointia sekä soluviljelyä polymeroiduilla rakenteilla.