Establishment and calibration of CRISPRi tools in Acinetobacter baylyi ADP1
Holmén, Olli (2019)
Holmén, Olli
2019
Bioengineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2019-02-13
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201902011198
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201902011198
Tiivistelmä
Regulating genes synthetically is important for metabolic engineering purposes. However, many organisms still lack established and optimized gene regulation techniques. CRISPR interference has emerged in the previous years as a promising gene repression tool. It is reversible, specific and the repression level can be regulated in multiple ways. CRISPRi has been successfully applied to many prokaryotic hosts including Escherichia coli, Pseudomonas putida and Pseudomonas aeruginosa. In this thesis CRISPRi tools were established in Acinetobacter baylyi ADP1 -bacteria for the first time.
DCas9 gene was embedded into ADP1’s genome and was expressed under a cyclohexanone inducible promoter while sgRNA was expressed from a plasmid under an arabinose inducible promoter. The repression levels were studied by silencing GFP gene which was integrated into the genome as well. Optimal inducer concentrations were 0.0002 mM of cyclohexanone and 1.0% of arabinose with the maximum repression of 3.8-fold compared to the uninduced strain containing only dCas9 but no sgRNA or 6.1-fold when compared to a strain without the CRISPRi machinery. Repression kinetics were investigated by silencing luxC gene from the luxCDABE operon (located in the genome): the repression started approximately 2 h after the induction of CRISPRi.
The burden caused by CRISPRi was investigated in terms of cell density and bioluminescence production, which functioned as a reporter of the cell’s metabolism. Increasing dCas9 expression decreased the cell growth rate. On the contrary, increasing sgRNA expression increased the growth rate when the dCas9 expression was kept constant. With the optimal inducer concentrations the growth was not affected. On the other hand, the optimal CRISPRi machinery expression (and 10-fold smaller dCas9 expression) levels decreased bioluminescence production. Hence, the CRISPRi machinery caused a burden to the cell on a metabolic level that was not visible in the growth of the bacteria.
Expression of dCas9 without GFP-targeting sgRNA repressed GFP expression by 1.4-fold. Possibly dCas9 binds to off-target genes and represses them, at least in the absence of sgRNA. The off-targeting by sgRNA:dCas9 complex was not studied. Geenien säätelyn kontrollointi on tärkeää monissa synteettistä biologiaa hyödyntävissä prosesseissa. Kaikille näissä prosesseissa käytetyille mikrobeille ei kuitenkaan ole vielä kehitetty toimivia ja optimoituja geenien säätelytekniikoita. Viime vuosien aikana CRISPRi (CRISPR häirintä) on kehittynyt lupaavaksi säätelytekniikaksi. Se on hyvin tarkka, sen hiljetämistasoa voidaan säätää monin eri keinoin ja geenin hiljentäminen on palautuvaa. Sitä onkin käytetty onnistuneesti jo monissa mikrobeissa, mukaan lukien Escherichia coli, Pseudomonas putida ja Pseudomonas aeruginosa. Tässä työssä CRISPRi työkalu otettiin ensi kerran käyttöön Acinetobacter baylyi ADP1 bakteerissa.
DCas9 geeni liitettiin ADP1:n genomiin ja sen ilmentymistä säädeltiin sykloheksanonilla indusoituvalla promoottorilla. SgRNA taas ilmennytettiin plasmidista arabinoosilla indusoituvan promoottorin avulla. Geenin hiljentämistä tutkittiin tukahduttamalla GFP geeni, joka myös sijaitsi genomissa. Ihanteellisiksi indusori pitoisuuksiksi löydettiin 0,0002 mM sykloheksanonia ja 1.0% arabinoosia, joilla saavutettiin maksimissaan 3,8-kertainen hiljentäminen verrattuna indusoimattomaan kontrollikantaan, jossa oli dCas9 geeni, mutta ei sgRNA:ta. Toisaalta 6,1-kertainen hiljentäminen saavutettiin kun kontrollikantana toimi kanta ilman CRISPRi koneistoa. Hiljentämisen kinetiikkaa tutkittiin kohdistamalla CRISPRi luxC geeniin luxCDABE operonista (sijaitsi genomissa), toisin sanoen tukahduttamalla bioluminesenssin tuotantoa. Geenin hiljentäminen alkoi noin kaksi tuntia indusoimisen jälkeen.
CRISPRi:n aiheuttamaa taakkaa soluille tutkittiin solujen kasvun ja bioluminesenssin tuotannon avulla. Bioluminesenssi kertoi tarkemmin solun sisäisestä metaboliasta. DCas9 pitoisuuden kasvattaminen aiheutti hitaampaa kasvua. Toisaalta sgRNA:n pitoisuuden nostaminen paransi kasvua kun dCas9 pitoisuus pysyi samana. Optimoiduilla indusoripitoisuuksilla vaikutusta kasvuun ei huomattu kontrollikantaan verrattuna. Kuitenkin optimoitujen (ja 10-kertaa pienemmän sykloheksanonipitoisuuden) indusoripitoisuuksien käyttäminen vähensi bioluminenessin tuotantoa. CRISPRi siis aiheutti soluille taakan, joka ei näkynyt kasvussa vaan vain metabolisella tasolla.
DCas9:n ilmentäminen ilman GFP geeniä tunnistavaa sgRNA:ta hiljensi GFP:n tuotantoa maksimissaan 1,4-kertaisesti. Tämä mahdollisesti johtui dCas9:n sitoutumisesta geeneihin ilman kohdentamista. Muiden kuin kohdegeenien hiljentymistä tutkittiin ainoastaan dCas9:n avulla joten tulevaisuudessa tutkittavaksi jäi, miten sgRNA:dCas9 kompleksi toimii samassa tilanteessa.
DCas9 gene was embedded into ADP1’s genome and was expressed under a cyclohexanone inducible promoter while sgRNA was expressed from a plasmid under an arabinose inducible promoter. The repression levels were studied by silencing GFP gene which was integrated into the genome as well. Optimal inducer concentrations were 0.0002 mM of cyclohexanone and 1.0% of arabinose with the maximum repression of 3.8-fold compared to the uninduced strain containing only dCas9 but no sgRNA or 6.1-fold when compared to a strain without the CRISPRi machinery. Repression kinetics were investigated by silencing luxC gene from the luxCDABE operon (located in the genome): the repression started approximately 2 h after the induction of CRISPRi.
The burden caused by CRISPRi was investigated in terms of cell density and bioluminescence production, which functioned as a reporter of the cell’s metabolism. Increasing dCas9 expression decreased the cell growth rate. On the contrary, increasing sgRNA expression increased the growth rate when the dCas9 expression was kept constant. With the optimal inducer concentrations the growth was not affected. On the other hand, the optimal CRISPRi machinery expression (and 10-fold smaller dCas9 expression) levels decreased bioluminescence production. Hence, the CRISPRi machinery caused a burden to the cell on a metabolic level that was not visible in the growth of the bacteria.
Expression of dCas9 without GFP-targeting sgRNA repressed GFP expression by 1.4-fold. Possibly dCas9 binds to off-target genes and represses them, at least in the absence of sgRNA. The off-targeting by sgRNA:dCas9 complex was not studied.
DCas9 geeni liitettiin ADP1:n genomiin ja sen ilmentymistä säädeltiin sykloheksanonilla indusoituvalla promoottorilla. SgRNA taas ilmennytettiin plasmidista arabinoosilla indusoituvan promoottorin avulla. Geenin hiljentämistä tutkittiin tukahduttamalla GFP geeni, joka myös sijaitsi genomissa. Ihanteellisiksi indusori pitoisuuksiksi löydettiin 0,0002 mM sykloheksanonia ja 1.0% arabinoosia, joilla saavutettiin maksimissaan 3,8-kertainen hiljentäminen verrattuna indusoimattomaan kontrollikantaan, jossa oli dCas9 geeni, mutta ei sgRNA:ta. Toisaalta 6,1-kertainen hiljentäminen saavutettiin kun kontrollikantana toimi kanta ilman CRISPRi koneistoa. Hiljentämisen kinetiikkaa tutkittiin kohdistamalla CRISPRi luxC geeniin luxCDABE operonista (sijaitsi genomissa), toisin sanoen tukahduttamalla bioluminesenssin tuotantoa. Geenin hiljentäminen alkoi noin kaksi tuntia indusoimisen jälkeen.
CRISPRi:n aiheuttamaa taakkaa soluille tutkittiin solujen kasvun ja bioluminesenssin tuotannon avulla. Bioluminesenssi kertoi tarkemmin solun sisäisestä metaboliasta. DCas9 pitoisuuden kasvattaminen aiheutti hitaampaa kasvua. Toisaalta sgRNA:n pitoisuuden nostaminen paransi kasvua kun dCas9 pitoisuus pysyi samana. Optimoiduilla indusoripitoisuuksilla vaikutusta kasvuun ei huomattu kontrollikantaan verrattuna. Kuitenkin optimoitujen (ja 10-kertaa pienemmän sykloheksanonipitoisuuden) indusoripitoisuuksien käyttäminen vähensi bioluminenessin tuotantoa. CRISPRi siis aiheutti soluille taakan, joka ei näkynyt kasvussa vaan vain metabolisella tasolla.
DCas9:n ilmentäminen ilman GFP geeniä tunnistavaa sgRNA:ta hiljensi GFP:n tuotantoa maksimissaan 1,4-kertaisesti. Tämä mahdollisesti johtui dCas9:n sitoutumisesta geeneihin ilman kohdentamista. Muiden kuin kohdegeenien hiljentymistä tutkittiin ainoastaan dCas9:n avulla joten tulevaisuudessa tutkittavaksi jäi, miten sgRNA:dCas9 kompleksi toimii samassa tilanteessa.