Heterogeenisen näytteen viskositeetin määritys fluoresenssielinaikamikroskoopilla
Valkama, Sirkku (2018)
Valkama, Sirkku
2018
Teknis-luonnontieteellinen
Teknis-luonnontieteellinen tiedekunta - Faculty of Natural Sciences
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2018-12-05
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201811262761
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201811262761
Tiivistelmä
In this study, a method for determining local viscosities from heterogeneous liquids using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and fluorescent molecular rotors was developed. The method was tested with two homogeneous and two heterogeneous samples and applied to determine the viscosities of silk protein coacervates from various silk samples. The fluorescent molecular rotors used were hydrophilic DASPMI and hydrophobic BODIPY. Fluorescence lifetimes of these molecules were determined in seven different viscosities and calibration curves that describe the viscosity dependence of the fluorescence lifetimes for these molecules were calculated from the results.
Comparable local viscosity values could be obtained from heterogeneous samples with this method. Imaging of these samples with FLIM was most successful when the sample droplet was placed between two glass plates separated by teflon tape during the measurement and water droplets were added to the glass plate in addition to the sample droplets. The best images from silk coacervates were obtained from centrifuged samples containing Tris-HCl buffer solution. When preparing FLIM samples containing salt induced "hard" coaservatives, the addition of the dye should be done after adding the K2HPO4 salt solution. The soft coacervates formed on the edges of the sample droplets during drying of the sample could not be measured with this method because the drying progressed too quickly. Instead, it was possible to image soft coacervates that already existed in the solution. Two exponential fittings were used for fluorescence decay curves determined from FLIM images of coacervates. The shorter lifetimes of DASPMI and longer lifetimes of BODIPY were used when calculating equivalent viscosities. When taking measurement accuracy into account the viscosities calculated from lifetimes of DASPMI were nearly identical in all silk coacervate samples. Some differences between samples could be discerned when comparing viscosities calculated from lifetimes of BODIPY. Tässä tutkimuksessa kehitettiin menetelmää, jolla voidaan fluoresenssielinaikamikroskooppia (fluorescence lifetime imaging microscope, FLIM) ja fluoresoivia roottorimolekyylejä käyttäen määrittää heterogeenisten nesteiden paikallisia viskositeetteja. Menetelmää testattiin kahdella homogeenisella ja kahdella heterogeenisellä näytteellä ja sovellettiin silkkiproteiinikoaservaattien viskositeettien määrittämiseen erilaisista silkkinäytteistä. Fluoresoivina roottorimolekyyleinä käytettiin hydrofiilistä DASPMIa ja hydrofobista BODIPYä. Näiden molekyylien fluoresenssin elinajat määritettiin seitsemässä eri viskositeetissa ja tuloksista määritettiin kalibraatiokäyrät, jotka kuvaavat roottorimolekyylien fluoresenssin elinaikojen riippuvuutta viskositeetista.
Menetelmän avulla pystyttiin määrittämään keskenään vertailukelpoisia paikallisia viskositeetteja heterogeenisista näytteistä. Näiden näytteiden kuvaaminen FLIM:llä onnistui parhaiten, kun näytepisara pidettiin mittauksen ajan kahden toisistaan teflonteipillä erotetun lasilevyn välissä ja lasilevylle lisättiin näytepisaroiden lisäksi myös vesipisaroita. Silkkikoaservaateista saatiin parhaat kuvat sentrifugoiduista Tris-HCl"-puskuriliuosta sisältävistä näytteistä. Kovia koaservaatteja sisältäviä FLIM-näytteitä valmistettaessa väriaineen lisääminen kannatti tehdä vasta K2HPO4-suolaliuoksen lisäämisen jälkeen. Näytepisaran reunoille näytteen kuivuessa muodostuvia pehmeitä koaservaatteja ei pystytty mittaamaan tällä menetelmällä, sillä kuivuminen eteni liian nopeasti. Sen sijaan näytteessä valmiina olevia pehmeitä koaservaatteja voitiin kuvata. Koaservaattinäytteistä mitatuista FLIM-kuvista määritettyihin fluoresenssin vaimenemiskuvaajiin sovitettiin kaksieksponentiaaliset sovitukset. DASPMIn elinajoista lyhyempää ja BODIPYn elinajoista pidempää käytettiin elinaikoja vastaavien viskositeettien laskemiseen. Koaservaateista DASPMIlla määritetyt viskositeetit olivat mittaustarkkuuden rajoissa lähes identtisiä, mutta BODIPYllä havaittiin eroja eri näytetyyppien välillä.
Comparable local viscosity values could be obtained from heterogeneous samples with this method. Imaging of these samples with FLIM was most successful when the sample droplet was placed between two glass plates separated by teflon tape during the measurement and water droplets were added to the glass plate in addition to the sample droplets. The best images from silk coacervates were obtained from centrifuged samples containing Tris-HCl buffer solution. When preparing FLIM samples containing salt induced "hard" coaservatives, the addition of the dye should be done after adding the K2HPO4 salt solution. The soft coacervates formed on the edges of the sample droplets during drying of the sample could not be measured with this method because the drying progressed too quickly. Instead, it was possible to image soft coacervates that already existed in the solution. Two exponential fittings were used for fluorescence decay curves determined from FLIM images of coacervates. The shorter lifetimes of DASPMI and longer lifetimes of BODIPY were used when calculating equivalent viscosities. When taking measurement accuracy into account the viscosities calculated from lifetimes of DASPMI were nearly identical in all silk coacervate samples. Some differences between samples could be discerned when comparing viscosities calculated from lifetimes of BODIPY.
Menetelmän avulla pystyttiin määrittämään keskenään vertailukelpoisia paikallisia viskositeetteja heterogeenisista näytteistä. Näiden näytteiden kuvaaminen FLIM:llä onnistui parhaiten, kun näytepisara pidettiin mittauksen ajan kahden toisistaan teflonteipillä erotetun lasilevyn välissä ja lasilevylle lisättiin näytepisaroiden lisäksi myös vesipisaroita. Silkkikoaservaateista saatiin parhaat kuvat sentrifugoiduista Tris-HCl"-puskuriliuosta sisältävistä näytteistä. Kovia koaservaatteja sisältäviä FLIM-näytteitä valmistettaessa väriaineen lisääminen kannatti tehdä vasta K2HPO4-suolaliuoksen lisäämisen jälkeen. Näytepisaran reunoille näytteen kuivuessa muodostuvia pehmeitä koaservaatteja ei pystytty mittaamaan tällä menetelmällä, sillä kuivuminen eteni liian nopeasti. Sen sijaan näytteessä valmiina olevia pehmeitä koaservaatteja voitiin kuvata. Koaservaattinäytteistä mitatuista FLIM-kuvista määritettyihin fluoresenssin vaimenemiskuvaajiin sovitettiin kaksieksponentiaaliset sovitukset. DASPMIn elinajoista lyhyempää ja BODIPYn elinajoista pidempää käytettiin elinaikoja vastaavien viskositeettien laskemiseen. Koaservaateista DASPMIlla määritetyt viskositeetit olivat mittaustarkkuuden rajoissa lähes identtisiä, mutta BODIPYllä havaittiin eroja eri näytetyyppien välillä.