Solumittauksiin soveltuvien fluoresoivien kemosensorien karakterisointi

Abstract

This master’s thesis was carried out at the Laboratory of Chemistry and Bioengineering, Tampere University of Technology. The objective was to study the changes in fluorescence lifetime and intensity of four different fluorescent probes. The purpose of the thesis study was to gain information about the usefulness of these fluorescent probes for the research on drug carriers, and studies of intracellular changes in the chemical microenvironment. The first stage was to study the suitability of two fluorescent probes, BCECF and LysoSensor Blue, as pH indicators. This was followed with studies of Fluo-3 as a calcium indicator, and of lucigenin as a chloride indicator. For spectroscopic studies, samples were made from all the probes, using either phosphate-buffered saline or ultrapure water. The absorption and fluorescence excitation and emission spectra were measured from all the samples. The fluorescence lifetimes of the samples were also measured using time correlated single photon counting (TCSPC). The lifetimes of BCECF and lucigenin were found to change significantly with the changes in their environment, making BCECF well suited as pH indicator, and lucigenin as chloride indicator, when using lifetime measurements. As the lifetime changes of LysoSensor Blue and Fluo-3 were either too small to measure or did not take place, these probes turned out to be unsuitable for TCSPC. However, all four fluorescent probes were found to be suitable for steady state measurements, for example using fluorescence microscopy, under typical intracellular conditions.

Tämä diplomityö tehtiin Tampereen teknillisen yliopiston kemian ja biotekniikan laitokselle. Työssä tarkasteltiin neljän fluoresoivan merkkiaineen fluoresenssin elinajan ja intensiteetin muuttumista muutettaessa tutkimusolosuhteita. Sen tarkoituksena oli saada tietoa kyseisten merkkiaineiden käyttökelpoisuudesta laitoksen tutkimusprojekteissa, joissa tutkitaan lääkeaineiden kuljetusta soluihin ja solunsisäisten olosuhteiden muutoksia. Aluksi tutkittiin kahden eri fluoresoivan merkkiaineen, BCECF:n ja LysoSensor Bluen, käyttöä pH-indikaattoreina. Tämän lisäksi tutkittiin Fluo-3:n käyttöä kalsiumindikaattorina, ja lusigeniinin käyttöä kloridi-indikaattorina. Merkkiaineista valmistettiin spektrimittauksia varten näyteliuokset joko fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen tai ultrapuhtaaseen veteen. Niistä mitattiin absorptiospektrit ja fluoresenssin eksitaatio- ja emissiospektrit, sekä fluoresenssin elinajat käyttäen aikaerotteista yksittäisfotonilaskentaa (TCSPC). BCECF:n ja lusigeniinin elinaikojen todettiin muuttuvan selkeästi olosuhteiden myötä. Täten BCECF soveltuu hyvin pH-määrityksiin sekä lusigeniini kloridikonsentraation määrittämiseen elinaikamittauksien avulla. Sen sijaan LysoSensor Blue ja Fluo-3 osoittautuivat sopimattomiksi elinaikamittauksiin, koska niiden elinajoissa joko ei tapahtunut havaittavia muutoksia, tai ne olivat satunnaisia. Kaikki merkkiaineet soveltuivat kuitenkin käytettäviksi stationäärisissä mittauksissa, kuten fluoresenssimikroskopiassa, normaaleissa solunsisäisissä olosuhteissa