A rapid cell culture protocol for screening material cytocompatibility
Naams, Jette-Britt (2016)
Naams, Jette-Britt
2016
Biotekniikan koulutusohjelma
Luonnontieteiden tiedekunta - Faculty of Natural Sciences
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2016-06-08
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201605264180
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201605264180
Tiivistelmä
Hydrogels differ from many other cell culture substrates in that they provide a three-dimensional, soft environment for cells, opposed to a two-dimensional surface on which cells are traditionally cultured. This geometry better represents the in vivo environment of cells. In addition, hydrogels are easily modified for enhanced cell viability and growth. Therefore, new hydrogels are continuously developed for cell culture and tissue engineering purposes.
Applicability of a hydrogel as cell culture substrate depends on several chemical and physical attributes. Together these attributes affect cytocompatibility of the hydrogel, i.e. cell attachment, viability and cell specific response. The objective of this thesis was to create a protocol for first-step, short-term cell culture screening of new hydrogels. Cytocompatibility testing and analysis methods need to be adjusted for macroscopic 3D hydrogels compared to 2D culturing systems. Another challenge in this screening is adequate stability of cells and their representativeness of the cells intended to be used in the final application.
An interview was conducted with Regenerative Medicine professionals in BioMediTech Institute (University of Tampere) who are working with cardiomyocytes, bone and cartilage cells, corneal and retinal epithelial cells, and neuronal cells. Knowledge was gathered on the properties of representable cell models of each cell type and on tissue-specific aspects of analyzing. A commercial human embryonic fibroblast cell line WI-38 was chosen as a representative first-step cell model and acquired for the first-step cytocompatibility testing. In addition, tissue specific cell lines were recommended for further testing.
Cells were cultured ontop and encapsulated in PuraMatrix® and gellan gum hydrogels, and on poly(dimethylsiloxane) (PDMS) and uncoated well plate. Cells were stained with Live/dead viability/cytotoxicity kit. The suitability of Nikon BioStation CT cell culture observation system was evaluated for the screening of hydrogels and compared with two other imaging systems. It was possible to assess cell attachment and viability from fluorescence images taken with BioStation CT, even though it was not an optimal imaging system for 3D hydrogel screening. As the result of this thesis, a first-step cytocompatibility testing protocol was created for assessing attachment and viability of cells that were cultured on top and encapsulated in hydrogels. Hydrogeelit eroavat monista muista soluviljelyalustoista niin, että ne tarjoavat soluille kolmiulotteisen, pehmeän kasvuympäristön. Perinteinen kasvualusta on sen sijaan kaksiulotteinen ja kova pinta. Hydrogeelien kolmiulotteinen (3D) ympäristö kuvastaa paremmin ympäristöä, jossa solut kasvavat kehossa. Lisäksi hydrogeelit ovat helposti kemiallisesti muokattavissa, jolloin solujen kasvua ja elinkykyisyyttä materiaalissa voidaan parantaa. Uusia hydrogeelejä kehitetäänkin jatkuvasti soluviljelyn ja kudosteknologian tarpeisiin.
Hydrogeelin soveltuvuus soluviljelyn kasvualustaksi on riippuvainen monista sen kemiallisista ja fysikaalisista ominaisuuksista. Nämä ominaisuudet vaikuttavat yhdessä hydrogeelin sytokompatibiliteettiin, eli solujen kiinnittymiseen, elinkykyisyyteen ja solutyypistä riippuvaan vasteeseen. Tämän diplomityön tarkoituksena oli kehittää lyhytaikaiseen soluviljelyyn perustuva protokolla uusien hydrogeelien alkuvaiheen seulontaan. Koe- ja analysointimenetelmiä on säädettävä sytokompatibiliteetin testaamiseksi, kun soluja kasvatetaan 3D-materiaalissa verrattuna kaksiulotteisella materiaalilla kasvattamiseen. Lisäksi seulonnan haasteena on solujen riittävä stabiilius sekä edustavuus verrattuna soluihin, joita on tarkoitus käyttää lopullisessa sovelluksessa.
Diplomityössä haastateltiin BioMediTech -instituutin (Tampereen yliopisto) Regeneratiivisen lääketieteen tutkimusryhmiä, jotka tutkivat kardiomyosyyttejä, luu- ja rustosoluja, verkkokalvon ja sarveiskalvon soluja sekä hermoston soluja. Haastattelussa kerättiin tietoa kutakin solutyyppiä edustavien solujen ominaisuuksista sekä näiden solutyyppien analysoimisesta. Kaupallinen ihmisen embryonaalinen fibroblastisolulinja WI-38 valittiin edustavaksi ensimmäisen vaiheen solumalliksi ja se hankittiin ensimmäisen vaiheen sytokompatibiliteettitestausta varten. Lisäksi jatkotutkimuksia varten ehdotettiin kudoskohtaisia solulinjoja.
Soluja kasvatettiin PuraMatrix®- ja gellaanikumihydrogeelien päällä ja sisällä, sekä polydimetyylisiloksaanilla (PDMS) ja päällystämättömällä kuoppalevyllä. Solut värjättiin Live/dead viabiliteetti/sytotoksisuus -kitillä. Nikon BioStation CT -kuvantamisjärjestelmän soveltuvuutta hydrogeelien seulontaan arvioitiin, ja sitä verrattiin kahteen muuhun kuvantamisjärjestelmään. BioStation CT:n avulla saaduista fluoresenssikuvista oli mahdollista määrittää solujen elinkykyisyys ja kiinnittyminen, mutta se ei kuitenkaan ollut optimaalinen 3D-hydrogeelien seulontaan. Diplomityön tuloksena tuotettiin sytokompatibiliteetin testausprotokolla, jota voidaan käyttää hydrogeelien päällä ja sisällä kasvatettujen solujen kiinnittymisen ja elinkykyisyyden määrittämiseksi.
Applicability of a hydrogel as cell culture substrate depends on several chemical and physical attributes. Together these attributes affect cytocompatibility of the hydrogel, i.e. cell attachment, viability and cell specific response. The objective of this thesis was to create a protocol for first-step, short-term cell culture screening of new hydrogels. Cytocompatibility testing and analysis methods need to be adjusted for macroscopic 3D hydrogels compared to 2D culturing systems. Another challenge in this screening is adequate stability of cells and their representativeness of the cells intended to be used in the final application.
An interview was conducted with Regenerative Medicine professionals in BioMediTech Institute (University of Tampere) who are working with cardiomyocytes, bone and cartilage cells, corneal and retinal epithelial cells, and neuronal cells. Knowledge was gathered on the properties of representable cell models of each cell type and on tissue-specific aspects of analyzing. A commercial human embryonic fibroblast cell line WI-38 was chosen as a representative first-step cell model and acquired for the first-step cytocompatibility testing. In addition, tissue specific cell lines were recommended for further testing.
Cells were cultured ontop and encapsulated in PuraMatrix® and gellan gum hydrogels, and on poly(dimethylsiloxane) (PDMS) and uncoated well plate. Cells were stained with Live/dead viability/cytotoxicity kit. The suitability of Nikon BioStation CT cell culture observation system was evaluated for the screening of hydrogels and compared with two other imaging systems. It was possible to assess cell attachment and viability from fluorescence images taken with BioStation CT, even though it was not an optimal imaging system for 3D hydrogel screening. As the result of this thesis, a first-step cytocompatibility testing protocol was created for assessing attachment and viability of cells that were cultured on top and encapsulated in hydrogels.
Hydrogeelin soveltuvuus soluviljelyn kasvualustaksi on riippuvainen monista sen kemiallisista ja fysikaalisista ominaisuuksista. Nämä ominaisuudet vaikuttavat yhdessä hydrogeelin sytokompatibiliteettiin, eli solujen kiinnittymiseen, elinkykyisyyteen ja solutyypistä riippuvaan vasteeseen. Tämän diplomityön tarkoituksena oli kehittää lyhytaikaiseen soluviljelyyn perustuva protokolla uusien hydrogeelien alkuvaiheen seulontaan. Koe- ja analysointimenetelmiä on säädettävä sytokompatibiliteetin testaamiseksi, kun soluja kasvatetaan 3D-materiaalissa verrattuna kaksiulotteisella materiaalilla kasvattamiseen. Lisäksi seulonnan haasteena on solujen riittävä stabiilius sekä edustavuus verrattuna soluihin, joita on tarkoitus käyttää lopullisessa sovelluksessa.
Diplomityössä haastateltiin BioMediTech -instituutin (Tampereen yliopisto) Regeneratiivisen lääketieteen tutkimusryhmiä, jotka tutkivat kardiomyosyyttejä, luu- ja rustosoluja, verkkokalvon ja sarveiskalvon soluja sekä hermoston soluja. Haastattelussa kerättiin tietoa kutakin solutyyppiä edustavien solujen ominaisuuksista sekä näiden solutyyppien analysoimisesta. Kaupallinen ihmisen embryonaalinen fibroblastisolulinja WI-38 valittiin edustavaksi ensimmäisen vaiheen solumalliksi ja se hankittiin ensimmäisen vaiheen sytokompatibiliteettitestausta varten. Lisäksi jatkotutkimuksia varten ehdotettiin kudoskohtaisia solulinjoja.
Soluja kasvatettiin PuraMatrix®- ja gellaanikumihydrogeelien päällä ja sisällä, sekä polydimetyylisiloksaanilla (PDMS) ja päällystämättömällä kuoppalevyllä. Solut värjättiin Live/dead viabiliteetti/sytotoksisuus -kitillä. Nikon BioStation CT -kuvantamisjärjestelmän soveltuvuutta hydrogeelien seulontaan arvioitiin, ja sitä verrattiin kahteen muuhun kuvantamisjärjestelmään. BioStation CT:n avulla saaduista fluoresenssikuvista oli mahdollista määrittää solujen elinkykyisyys ja kiinnittyminen, mutta se ei kuitenkaan ollut optimaalinen 3D-hydrogeelien seulontaan. Diplomityön tuloksena tuotettiin sytokompatibiliteetin testausprotokolla, jota voidaan käyttää hydrogeelien päällä ja sisällä kasvatettujen solujen kiinnittymisen ja elinkykyisyyden määrittämiseksi.