Extracellular Signals Of Neuronal Networks In Restricted Culture Volumes

Abstract

Neurotoxicity testing is mostly done in vivo using animal models. However, in order to reduce costs and time needed for the neurotoxicity testing, in vitro methods could be utilized. In addition, the use of human cell based in vitro models would eliminate the need of animal-to-human extrapolations. Microelectrode arrays (MEAs) are tools for measuring extracellular signals of neuronal networks in vitro. However, the extracellular spikes are small and remain easily unrecorded and undistinguished from the background noise. The extracellular spike amplitudes can be amplified by long and narrow microchannels that restrict the extracellular volume, thus increasing the extracellular resistance. The aim in this thesis was to design and test structures that could amplify the extracellular signals of neuronal networks. Neurons were differentiated from human pluripotent stem cells (hPSCs) and cultured in polydimethylsiloxane (PDMS) channel structures on MEAs. The spontaneous electrical activity of the networks was measured for five weeks. The MEA signal analysis results were compared to standard MEA controls. The human derived neurons were successfully cultured in the PDMS channel structures. More spontaneous activity was detected in the channel structures compared to the controls. Higher portion of electrodes were active in the tested channel structures (50–100 %) compared to controls (less than 50 %). Also, higher spike and burst counts were obtained in the channel structures than in the controls. The narrowest (100 µm wide) and lowest (50 µm high) channels had especially high portion of active electrodes, high spike and burst counts. However, extracellular spike amplification was not observed in the tested channels. The channel structures affected the neuronal network organization which can affect the spontaneous activity. Also, the channel structures may have amplified small spikes that would have otherwise remained undistinguished from the background noise. The differences in the MEA results between the channel structures and the controls may partly result from electrode differences. The noise level was the highest and the signal-to-noise ratio (SNR) was the weakest in the controls, which can explain the lower number of detected spikes. However, differences in spike and burst counts among the channel structures cannot be explained by different noise levels. In addition, biological variation can affect the results since the number of cultures was relatively low for some of the structure types.

Neurotoksisuustestaus tehdään nykyisin pääasiassa eläinmallien avulla. Kustannusten ja ajan säästämiseksi testauksessa kannattaisi kuitenkin hyödyntää in vitro menetelmiä. Lisäksi testaus ihmisperäisillä malleilla antaisi luotettavampaa tietoa erilaisten aineiden vaikutuksista ihmiseen. Mikroelektrodihilalla (MEA) voidaan mitata hermoverkkojen solunulkoisia signaaleja. Solunulkoiset aktiopotentiaalipiikit ovat kuitenkin pieniä ja jäävät helposti taustakohinan alle. Solunulkoisia signaaleja voidaan vahvistaa pitkillä ja kapeilla mikrokanavilla, jotka rajoittavat solunulkoista nestetilavuutta lisäten solunulkoista resistanssia. Tässä työssä tavoitteena oli suunnitella ja testata rakenteita, jotka vahvistaisivat hermoverkkojen solunulkoisia signaaleja. Ihmisen pluripotenteista kantasoluista erilaistettiin neuroneja, joita kasvatettiin polydimetyylisiloksaanista (PDMS) valmistetuissa kanavarakenteissa MEA:n päällä. Hermoverkkojen spontaania sähköistä aktiivisuutta mitattiin viiden viikon ajan. MEA-mittaustuloksia verrattiin kontrollikasvatuksista saatuihin tuloksiin. Neuroneja kasvatettiin onnistuneesti PDMS-rakenteissa. Kanavarakenteissa havaittiin enemmän spontaania aktiivisuutta kuin kontrollikasvatuksissa. Kanavatyypistä riippuen 50–100 % elektrodeista luokiteltiin aktiivisiksi, kun kontrolleissa luku oli alle 50 %. Lisäksi piikki- ja burstimäärät olivat suurempia kanavarakenteissa kuin kontrollikasvatuksissa. Erityisesti kapeimmissa (100 µm) ja matalimmissa (50 µm) kanavissa oli suuri aktiivisten elektrodien osuus, sekä suuret piikki- ja burstimäärät. Solunulkoisten signaalien vahvistumista ei kuitenkaan havaittu testatuissa kanavissa. Hermoverkko muodostui erilaiseksi kapeissa ja leveissä kanavissa sekä rajoittamattomissa kontrolliviljelmissä, mikä voi vaikuttaa verkoston spontaaniin aktiivisuuteen. Kanavarakenteet ovat voineet myös vahvistaa pieniä piikkejä kohinatason yläpuolelle. PDMS-rakenteiden ja kontrollien väliset erot MEA-tuloksissa voivat osaltaan johtua myös elektrodien välisistä eroista. Kohinatasot olivat korkeammat ja signaalin ja kohinan suhde (SNR) matalampi kontrolleissa kuin kanavarakenteissa. Tämä saattoi vaikuttaa vähäisempään havaittujen piikkien määrään kontrolleissa. Erisuuruiset kohinatasot eivät kuitenkaan selitä eri kanavarakenteiden välisiä piikki- ja burstimäärien eroja. Biologinen vaihtelu voi vaikuttaa tuloksiin, sillä kasvatusten lukumäärä jäi vähäiseksi osalle kanavatyypeistä.