DNA-peptidi nanopartikkeleiden muodostumisen tutkiminen aikaerotteisen fluoresenssispektroskopian avulla
Jukola, Riina (2014)
2014
Teknis-luonnontieteellinen koulutusohjelma
Luonnontieteiden tiedekunta - Faculty of Natural Sciences
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2014-08-13
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201408211379
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tty-201408211379
Tiivistelmä
Geenihoito on lupaava tulevaisuuden hoitomuoto. Geenihoito perustuu viallisen geenin korvaamiseen vastaavalla terveellä geenillä. Jo toteutuneissa geenihoidoissa korvaavat geenit on pääosin kuljetettu kohdesoluun viruksien avulla, mutta geeninsiirtoa DNA-pohjaisilla partikkeleilla tutkitaan lisääntyvässä määrin. Geeninsiirtoon kuuluu monia vaiheita: DNA sitoutuu kationiseen kuljettaja-aineeseen, kulkeutuu soluun, vapautuu kuljettaja-aineesta ja kulkeutuu tumaan. Kationisten polymeerien ja peptidien geeninsiirtoa on tutkittu soluissa transfektiokokeilla, mutta menetelmä on kallis ja hidas. Fluoresenssispektroskopian avulla voidaan tutkia DNA:n sitoutumista partikkeleiksi, eli geeninsiirron ensimmäistä vaihetta tehokkaammin.
Fluoresenssispektroskopiset tutkimukset perustuvat fluoresoivien yhdisteiden, tässä työssä etidiumbromidin käyttöön fluoresoivana merkkiaineena. Kun etidiumbromidi sitoutuu DNA:n fosfaattiryhmiin, sen fluoresenssin elinaika muuttuu. Liuoksessa läsnä oleva kationinen polymeeri tai peptidi sitoutuu DNA:han ja etidiumbromidi irtoaa. Kuljettaja-aineeseen sitoutuneen DNA:n määrää voidaan tutkia määrittämällä missä suhteessa liuoksessa olevasta etidiumbromidista on vapaana tai sitoutunut DNA:han. Tämän lisäksi työssä on esitetty kaksi erilaista tapaa mallintaa sitoutumista.
Työssä keskityttiin peptidin (KK)2KGGC ja DNA:n keskinäiseen sitoutumiseen. Mittauksia tehtiin kolmessa eri puskuriliuoksessa ja kahdella eri pH-arvolla. Työssä määritettiin myös DNA-peptidipartikkelien kokoja eri DNA-peptidi-suhteilla. Partikkelien koon havaittiin kasvavan peptidilisäyksen funktiona, kunnes lähes kaikki DNA:n fosfaattiryhmät olivat sitoutuneet. Ylimääräpeptidi puolestaan pienensi partikkelikokoa.
Happamammissa olosuhteissa peptidi sitoi tehokkaammin DNA:ta, mutta myös puskurien välillä oli eroa samassa pH-arvossa. Vaikuttaa siltä, että puskurin ionivahvuudella on suuri merkitys DNA-peptidipartikkelin muodostumiseen. Matalammassa ionivahvuudessa DNA-peptidipartikkelin sitoutuminen oli positiivisesti kooperatiivista, eli ensimmäinen sitoutunut peptidin aminoryhmä edesauttoi seuraavien sitoutumista. Vahvemmassa ionivahvuudessa sitoutuminen oli alkuun riippumatonta ja positiivisesti ko-operatiivista vasta kun peptidin konsentraatio oli riittävän korkea.
Fluoresenssispektroskopiset tutkimukset perustuvat fluoresoivien yhdisteiden, tässä työssä etidiumbromidin käyttöön fluoresoivana merkkiaineena. Kun etidiumbromidi sitoutuu DNA:n fosfaattiryhmiin, sen fluoresenssin elinaika muuttuu. Liuoksessa läsnä oleva kationinen polymeeri tai peptidi sitoutuu DNA:han ja etidiumbromidi irtoaa. Kuljettaja-aineeseen sitoutuneen DNA:n määrää voidaan tutkia määrittämällä missä suhteessa liuoksessa olevasta etidiumbromidista on vapaana tai sitoutunut DNA:han. Tämän lisäksi työssä on esitetty kaksi erilaista tapaa mallintaa sitoutumista.
Työssä keskityttiin peptidin (KK)2KGGC ja DNA:n keskinäiseen sitoutumiseen. Mittauksia tehtiin kolmessa eri puskuriliuoksessa ja kahdella eri pH-arvolla. Työssä määritettiin myös DNA-peptidipartikkelien kokoja eri DNA-peptidi-suhteilla. Partikkelien koon havaittiin kasvavan peptidilisäyksen funktiona, kunnes lähes kaikki DNA:n fosfaattiryhmät olivat sitoutuneet. Ylimääräpeptidi puolestaan pienensi partikkelikokoa.
Happamammissa olosuhteissa peptidi sitoi tehokkaammin DNA:ta, mutta myös puskurien välillä oli eroa samassa pH-arvossa. Vaikuttaa siltä, että puskurin ionivahvuudella on suuri merkitys DNA-peptidipartikkelin muodostumiseen. Matalammassa ionivahvuudessa DNA-peptidipartikkelin sitoutuminen oli positiivisesti kooperatiivista, eli ensimmäinen sitoutunut peptidin aminoryhmä edesauttoi seuraavien sitoutumista. Vahvemmassa ionivahvuudessa sitoutuminen oli alkuun riippumatonta ja positiivisesti ko-operatiivista vasta kun peptidin konsentraatio oli riittävän korkea.