Front-end Electronics for Fast in Vitro Biological Measurements.

Abstract

Epithelium forms tight membranes that efficiently take part in secretion and absorption between the two lining tissues. A tight membrane of this nature has a low DC conductivity and this is generally used to assess the integrity of cultured epithelium cell layers. Recent studies have shown that impedance spectroscopy gives more information about the electrophysiological structure of the cells. Collaborative research by Department of Biomedical Engineering at Tampere University of Technology and stem cell research group at University of Tampere has shown that electrochemical impedance spectroscopy is useful in assessing the maturity and functionality of differentiated retinal pigment epithelium (RPE) cells. However the time expenditure of the traditional frequency sweeping method is a poor candidate for drug permeability or multichannel studies where several frequency responses have to be measured within a short time. The aim of this Thesis was to develop the front end electronics for fast impedance spectroscopy measurement employing inverse-repeat binary sequence as the broadband excitation signal. Also the DC potential across the cell membrane was to be measured with the device. The developed device was first tested using a custom built test box and plastic film as artificial membrane. In addition several electrode materials were used to study the observed polarization impedances. Further testing with differentiated RPE cell layers was done using the Ussing chamber and the well plate setups that are commonly used in cell culturing studies. All the measured frequency responses were referenced with a commercial device widely used in epithelium research. The observed measurement differences between the device and the reference were largely caused by the load dependent output current of the device and by the electrode polarization taking place at the voltage measurement electrodes. Due to the input current error the relative difference of the measured impedance levels was typically from 5 % to 10 % with load impedances larger than 700 ohms. With lower load impedances the measured relative difference increased rapidly. A method to compensate for the input current error is presented in this thesis. DC potential measurements with the device were not successful as the electrodes used had very high offset voltages. The frequency responses measured with the device give a good measure of the capacitance present in the cell layer. Capacitance of the cell layer can be used to assess the maturity of the cell layer and for such purpose the device suits well. For impedance level measurements the device has a relatively large error margin and further research needs to be done to improve the accuracy and to eliminate the DC current flow. In addition the accuracy of the measurement system would improve by dividing the input stage between the DC potential and frequency response measurements. Also more carefully designed electrodes would help to control the electrode offset voltages.

Epiteelisolut muodostavat tiivisliitoksia, jotka ovat tärkeässä roolissa kudosten välillä tapahtuvassa erityksessä sekä absorptiossa. Tiivisliitoksen tasavirtajohtavuus on heikko ja tätä ominaisuutta hyödynnetään yleisesti viljeltyjen epiteelisolukerrosten tiiviyden sähköisessä tarkastelussa. Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että impedanssispektroskopia antaa enemmän tietoa solujen elektrofysiologisesta rakenteesta kuin yksinkertainen resistanssimittaus. Tampereen Teknillisen Yliopiston Biolääketieteen laitos sekä Tampereen Yliopiston kantasolututkimusryhmä ovat yhteistyössä osoittaneet elektrokemiallisen impedanssispektroskopian soveltuvan kantasoluista erikoistettujen retinan pigmenttiepiteelisolujen (RPE) kypsyyden ja toiminnallisuuden arviointiin. Perinteiset taajuuspyyhkäisyä hyödyntävät taajuusvasteanalysaattorit soveltuvat kuitenkin hitaudeltaan heikosti tutkimuksiin, joissa mittauskohteessa tapahtuu nopeita muutoksia tai missä useita taajuusvasteita mitataan lyhyellä aikavälillä. Tämän diplomityön tavoitteena oli kehittää pääteasteen elektroniikka mittausjärjestelmälle, joka hyödyntää laajakaistaista binäärijaksoa herätesignaalina ja mahdollistaa näin huomattavasti nopeamman impedanssispektroskopian. Kehitettävän laitteen tuli myös mitata solukerroksen yli oleva DC potentiaali. Diplomityössä kehitettyä laitetta testattiin aluksi in vitro mittauksia varten kehitetyllä testijärjestelmällä, jossa solukerrosta jäljiteltiin ohuella muovikalvolla. Näissä mittauksissa testattiin myös eri elektrodimateriaalien vaikutus havaittuun polarisaatioimpedanssiin. Viljeltyjen RPE solujen taajuusvasteita mitattiin työssä käyttäen sekä Ussingin kammio- että kuoppalevymittausasetelmia. Laitteella mitattujen taajuusvasteiden hyvyyttä arvioitiin vertaamalla tuloksia kaupallisella taajuusvasteanalysaattorilla mitattuihin vasteisiin. Kehitetyllä laitteella mitattujen vasteiden ero analysaattorilla mitattuihin johtui suurilta osin herätevirran riippuvuudesta kuormasta sekä jännitemittauselektrodien polarisaatioimpedansseista. Yli 700 ohmin kuormilla herätevirrasta aiheutuva virhe oli tyypillisesti 5% – 10 %, kun taas matalimmilla kuormilla virhe kasvoi nopeasti. Tämän virheen kompensoimiseksi on kuitenkin esitetty metodi tässä diplomityössä. Epiteelisolukerroksen yli olevaa DC jännitettä ei onnistuttu mittaamaan johtuen käytettyjen elektrodien korkeista offset-jännitteistä. Tässä diplomityössä kehitetyllä laitteella mitatut taajuusvasteet noudattavat hyvin analysaattorilla mitattujen vasteiden käyrämuotoja ja laite soveltuu täten solukerroksen kapasitanssin arviointiin. Solukerroksen kapasitanssia voidaan käyttää apuna solujen kypsyyden arvioinnissa. Laitteella mitatut impedanssitasot eroavat kuitenkin analysaattorilla mitatuista ja jatkokehitys DC virtojen eliminoimiseksi sekä elektrodien erisuuruisten offset-jännitteiden kompensoimiseksi on suositeltavaa.