Expression and characterization of full length Interferon gamma in mammalian cells

Abstract

Interferon gamma (IFNγ) is an immunomodulatory cytokine hormone, which participates in producing a host defense response to viral and bacterial infections. It has an important role in coordinating expression of immunologically relevant genes overall the human body. Malfunction of IFNγ signaling has been associated with many diseases, for instance deficiencies in resistance to infections such as tuberculosis, and autoimmune diseases including diabetes mellitus and multiple sclerosis. IFNγ acts via binding to the extracellular domains of its two specific transmembrane receptors, IFNγR1 and IFNγR2, which consequently bind signaling proteins on their intracellular domains, causing a signaling cascade into the nucleus. In this study, IFNγ and its two full length receptors were expressed and purified using protocols modified from previous studies of another transmembrane receptor rhodopsin. The structure of expressed IFNγ and binding of putative antibodies against IFNγ was analyzed using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. IFNγ and IFNγR1 were successfully expressed transiently in COS-1 cell line, while IFNγR2 was stably expressed in HEK-293 cell line. Full length IFNγR1 and IFNγR2 were found to be expressed as covalently bound dimers with high resistance to reducing conditions. Expressed IFNγ was observed to undergo partial cleavage of glycosylation products and dimerization during storage. Overall, the experimented protocols produced the desired target proteins as heavily glycosylated forms with a high tendency for covalent oligomerization. The comparison of measured 2D NMR spectrum with an assigned reference spectrum confirmed the identity of the expressed full length IFNγ. One of the examined putative antibodies against IFNγ was observed to bind to the dimer interface and shift the NMR spectrum towards closer correspondence with monomeric IFNγ. Antibody binding is thus expected to change the conformation of IFNγ towards its native state from the observed higher oligomerization states and disturb its signaling function by disrupting the active dimer. In these experiments, enough protein was expressed for confirming the identity and functionality of IFNγ signaling complex proteins, and for a preliminary study of antibody binding. In order to produce sufficiently protein for studying the interactions of the IFNγ signaling complex in more detail, an inducible stably expressing cell line needs to be established for both receptors and IFNγ. The results of conducted NMR experiments show feasibility of detailed NMR studies of the mechanisms of protein-protein interactions both within the IFNγ signaling complex and with antibodies, in view of drug development.

Interferon gamma (IFNγ) on immuunijärjestelmän sytokiinihormoni, joka osallistuu kehon puolustusreaktion aikaansaamiseen virus- ja bakteeri-infektioissa. Sillä on myös tärkeä rooli immuunijärjestelmän kannalta olennaisten geenien ilmentymisen säätelyssä kehon eri osissa. Monien sairauksien ilmenemiseen liittyy häiriöitä IFNγ-signaalinvälityksessä. IFNγ:n toimintahäiriö on yhdistetty muun muassa altistumisherkkyyteen tuberkuloosille ja useille muille infektiosairauksille sekä autoimmuunisairauksiin, kuten diabetekseen ja multippeliskleroosiin. IFNγ vaikuttaa sitoutumalla kahden kalvoreseptorinsa, IFNγR1:n ja IFNγR2:n, solunulkoisiin osiin. Tämän seurauksena reseptorien solunsisäisiin osiin liittyy spesifisiä viestinviejäproteiineja aikaansaaden tumaan johtavan viestinvälitysketjun. Tässä tutkimuksessa IFNγ ja sen molemmat reseptorit ilmennettiin ja puhdistettiin soveltamalla aiemmin tutkitun kalvoreseptorin, rhodopsinin, tuottamiseen käytettyjä menetelmiä. NMR-spektroskopialla suoritettiin tuotetun IFNγ:n rakenneanalyysi sekä tutkittiin sen sitoutumista kehitteillä oleviin IFNγ-vasta-aineisiin. IFNγ ja IFNγR ilmennettiin tilapäisesti tuottavassa COS-1 solulinjassa, kun taas IFNγR2:lle rakennettiin jatkuvasti tuottava HEK-293 solulinja. Täysmittaiset IFNγR1 ja IFNγR2 ilmenivät kovalenttisesti sitoutuneina dimeereinä, jotka pysyivät sitoutuneina tavallisesti neutraloivissa olosuhteissa. Tuotetussa IFNγ:ssa havaittiin osittaista glykosylaatiotuotteiden pilkkoutumista ja dimerisaatiota säilytettäessä sekä 4 °C että -20 °C lämpötilassa. Sovelletut proteiinien ilmentämis- ja puhdistusmenetelmät tuottivat siis kohdeproteiineja vahvasti glykosyloituneina muotoina, joilla oli taipumus oligomerisoitua kovalenttisesti. Ilmennetyn IFNγ:n identiteetti vahvistettiin vertaamalla sen mitattua 2D NMR-spektriä tunnettuun referenssispektriin. Yhden tutkituista vasta-aineista havaittiin sitoutuvan dimeerin rajapinnalla sijaitseviin aminohappoihin ja siirtävän NMR-spektriä kohti monomeerisen IFNγ:n spektriä. Vasta-aineen sitoutuminen todennäköisesti muuttaa IFNγ:n konformaatiota ja ehkäisee sen viestinvälitystoimintoa murtamalla aktiivisen dimeerin monomeereiksi. Tässä tutkimuksessa onnistuttiin tuottamaan riittävästi proteiinia ilmennetyn IFNγ:n identiteetin ja toiminnallisuuden todentamiseksi sekä vasta-aineiden sitoutumisen alustavaan analyysiin. Jotta IFNγ:n signaalinvälitysmekanismien yksityiskohtaiseen tutkimukseen saadaan riittävästi proteiinia, on sekä IFNγ:lle että sen molemmille reseptoreille vakiinnutettava indusoituva jatkuvatuottoinen solulinja. Suoritettujen NMR-kokeiden tulokset osoittavat, että NMR-analyysi on käyttökelpoinen menetelmä sekä INFγ-signaalinvälitysketjun että sitä vastaan kehitettävien vasta-aineiden proteiini–proteiini-vuorovaikutusten tutkimukseen.