Toxicity of Silver Nanoparticles and Induced Cytokine Expression with Special Reference to the Rat Cochlea

Abstract

Hopeananopartikkeleiden myrkyllisyys sekä sytokiinien ilmeneminen soluviljelmässä ja rotan sisäkorvassa

Hopeananopartikkelit (AgNP) ovat yleisimpiä teollisesti valmistetuista metallipohjaisista nanopartikkeleista. AgNP:llä on hyvä teho bakteereita, viruksia ja sieniä vastaan ja niitä on käytetty mm. pitkittyneessä välikorvan tulehduksessa. Yleistynyt AgNP.n käyttö on herättänyt huolta näiden mahdollisista haittavaikutuksista ihmiselle. Sisäkorvapohjaisista haittavaikutuksista on toistaiseksi puutteellisesti tietoa. AgNP:n haittavaikutuksia ja myrkyllisyyttä voidaan selvittää useilla eri menetelmillä. Menetelmät ovat eivät ole standardisoituja ja siksi tulokset ovat olleet vaihtelevia. Viime aikoina erilaiset vaihtoehtoiset menetelmät (esim. solu- ja kudos viljelmät) ovat tulleet osittain korvaaman koe-eläimillä tehtyjä tutkimuksia EU:n jäsenmaissa. EU:n seitsemäs puiteohjelma sisälsi toksisuuden menetelmän standardoinnin, joista yksi oli NanoValid tutkimuskonsortio (http://www.nanovalid.eu/), johon tämä tutkimus liittyy.

Aikaisemmat tukitusryhmämme tulokset osoittivat rotan sisäkorvan olevan sangen monipuolinen ja sopiva mallielin lääkeaineiden farmakologian ja myrkyllisyyden tutkimukselle. Korva toimintaa voidaan mitata hyvin tarkasti. Se sisältää eri kudoksia, kuten pintakudosta (korvakäytävän ihoa, välikorvan limakalvoa), aistinelimiä (kuuloelin, kaarikäytävät ja korvakristallielimet), aivohermoja (kuulohermon spiraaliganglio, tasapainohermon Scarpan ganglio). Sisäkorvalla on aivojen kanssa samanlainen verisuonijärjestelmä, (veri-sisäkorva este ja rajapinta), joka rajaa aineiden pääsyä sisäkorvaan ja suojaa sisäkorvan herkkää nestekiertoa eli homeostaasia. Haitallisten aineiden vaikutuksia voidaan selvittää korvakäytävän iholla, välikorvan limakalvolla ja myös sisäkorvassa. Sisäkorvan rajapintojen läpäisevyyttä voidaan selvittää käyttämällä gadolinium-pohjaisessa magneettikuvauksessa (MRI). AgNP voidaaan osoittaa korvassa mikro –tietokonetomografialla (µCT). Tämän ohella mahdolliset kuulossa ilmenevät muutokset voidaan tutkia aivorunkoaudiometrillä (ABR). Muutoksia solujen proteiinirakenteisten välisen viestinnän välittäjäaineiden (sytokiinien) erityksessä voidaan mitata vasta-ainemenetelmällä ja osoittaa konfokaalimikroskopilla.

Tässä tutkimuksessa selvitettiin AgNP:n myrkyllisyyttä ensin soluviljelykokeilla BALB/c3T3 soluviljelmässä ja rotan sisäkorvan soluilla. Kulkeutumista rotan sisäkorvaan selvitettiin ruiskuttamalla välikorvaan AgNP-pohjaista liuosta eri pitoisuuksina ja kuvaamalla kulkeutumista µCT:llä. Rajapintojen läpäisevyyttä selvitettiin gadolinium-varjoaine MRI:llä. AgNP:n aiheuttamat muutokset kuulossa selvitettiin ABR:llä. Kudosreaktioita tutkittiin immunohistologisin menetelmin.

AgNP aiheutti solun tyvikalvossa merkittäviä muutoksia, ja sisäkorvamuutokset olivat samanalaisia kuin munuaisissa ilmentyneet vauriot. Soluviljelmissä ilmenneet vauriot ilmenivät 1000 pienemmillä pitoisuuksilla kuin sisäkorvassa ilmenneet muutokset. Suuremmilla AgNP-pitoisuuksilla koe-eläinten kuulo heikkeni. AgNP sitoutuu solujen hyoluraanihappoon ja vaikuttaa siten eri kudoksen toimintaa. AgNP aiheuttaa myös sytokiini-reaktion, jossa CD68 sytokiinia aloitetaan tuottaa. Tämä ilmeisesti vaikuttaa TRL4 reseptorin aktivoitumiseen. A20 ja RNF11 sytokiinit ilmeisesti vaikuttavat haittaavasti sisäkorvan homeostaasiin. AgNP aktivoi myös tulehduksellisia sytokiineja.

Tulokset osoittavat, että AgNP aiheutti suurempina pitoisuuksina solukuolemia sekä kudostuhoa. AgNP-pohjaisten liuosten pitoisuudet tulisi rajata ja kliiniset käyttöindikaatiota tulisi kontrolloida nykyistä tarkemmin. Nanopartikkeleiden myrkyllisyyden tutkimisessa rotan sisäkorva-malli osoittautui toimivaksi ja sitä voi suositella myös muiden teollisten nanopartikkeleiden myrkyllisyyden tutkimiseen.

Silver nanoparticles (Ag NPs) are one of the most prevalent metal nanoparticles. They display potent anti-bacterial, anti-viral, and anti-fungal activities and are reportedly efficient in treating otitis media. However, increasing applications of Ag NPs have raised concerns as to their potential adverse effects on human health. In particular, possible toxicological mechanism in the cochlea is not well documented.

Currently, various methods are used to evaluate the toxicity of Ag NPs. However, they are quite complicated and vary from case to case when applied. Recently, alternative methods (e.g., tissue equivalents) have been accepted in the in vivo study for regulatory purpose in Europe. Therefore, the European Union 7th framework programme large-scale integrating project NanoValid is launched and attempts to establish the new reference methods in nanotoxicology (http://www.nanovalid.eu/).

Previous studies from our group showed that the rat ear was as an excellent multifunctional model in pharmacological and toxicological research due to its unique and sophisticated structure that houses epithelia (e.g., the skin of the external ear canal and mucosa of the middle ear), sensory organs (e.g., Corti’s organ, crista ampullaris, saccule maculae, and utricle maculae), neurons of the cranial nerves (e.g., spiral ganglion and Scarpa’s ganglion), a vascular bed similar to the brain, and a biological barrier (the blood-inner ear barrier) that limit the entry of hazardous substances to avoid compromising the vulnerable homeostasis of the inner ear. Therefore, it is assumed that not only can the impact on the skin of the external ear canal and mucosa of the middle ear be shown but also potential hazardous effects on the sensory organs can be evaluated using gadolinium-enhanced MRI with high accuracy and sensitivity when Ag NPs cross the biological barriers and enter the inner ear. In addition, possible effects on hearing caused by Ag NPs can be studied by ABR measurements, and possible alterations in cytokine expression in the inner ear exposed to Ag NPs can be identified by immunostaining using confocal microscopy.

The current study aimed to evaluate the toxicity of Ag NPs by comparing its effects on BALB/c 3T3 and rat cochlear cells. Moreover, the transportation and distribution of Ag NPs in the rat ear after transtympanic injection was demonstrated using micro CT and the impact of Ag NPs on the permeability of biological barriers in the rat ear was shown using gadolinium-enhanced MRI. Finally, the molecular mechanism of Ag NPs-induced functional change in the biological barriers in the rat cochlea was elucidated using immunohistochemistry.

The outlined results suggest that the delivery concentration of Ag NPs in possible future clinical application should be tightly controlled. The rat ear model might be expanded to study other engineered nanomaterials in nanotoxicology research.