Characterization of osteogenic differentiation mechanisms of human adipose stem cells in response to BMP-2 and bioactive glasses

Abstract

Väestön ikääntymisen myötä onnettomuuksien ja sairauksien aiheuttamien luuvaurioiden määrä kasvaa jatkuvasti. Luun kudosteknologia on nuori tieteenala, joka yhdistää biomateriaalitukirakenteen, solut sekä solujen proliferaatiota ja erilaistumista tukevia tekijöitä, ja tarjoaa näin lupaavan menetelmän luuvaurioiden hoitoon ilman perinteisenä hoitomuotona käytettyjen luusiirteiden haittoja. Luun kudosteknologiaa ajatellen rasvan kantasolut ovat suotuisa soluvalinta, sillä ne ovat erilaistumiskyvyltään multipotentteja ja eristettävissä suurella saannolla helposti saatavilla olevasta rasvakudoksesta. Luun kudosteknologiaan perustuvat, rasvan kantasoluja käyttävät hoidot ovatkin jo tuottaneet lupaavia tuloksia useissa yksittäisissä potilastapauksissa. Huolimatta kudosteknologisten menetelmien nopeasta kehityksestä, molekyylitason soluvasteet erilaisiin kemiallisiin sekä biomateriaalin aikaansaamiin ärsykkeisiin tunnetaan kuitenkin vielä huonosti.

Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin luun morfogeneettinen proteiini-2 (BMP-2) – kasvutekijän sekä bioaktiivisen lasin aiheuttamia luu- ja rasvaerilaistumisvasteita sekä niihin liittyviä solunsisäisiä signalointivaikutuksia ihmisen rasvan kantasoluissa. Kliinisestikin käytettyä BMP-2:a pidetään voimakkaana luuerilaistajana, mutta viimeisimmän tutkimustiedon valossa sen aiheuttamat soluvasteet eivät ole yhteneviä. Tämän vuoksi BMP-2:n vaikutusta luu- ja rasvaerilaistumiseen sekä kanoniseen Smad-signalointireittiin analysoitiin usealta eri luovuttajalta peräisin olevissa rasvan kantasoluissa. Lisäksi tutkittiin kasvatusliuoksen (ihmisseerumi-/naudan seerumipohjainen) sekä BMP-2:n tuottoalkuperän (Escherichia coli/nisäkässolut) vaikutusta kasvutekijän toimintaan. Mitä tulee luun kudosteknologiassa käytettyihin biomateriaaleihin, bioaktiivisia laseja pidetään erityisen hyödyllisinä niiden luuerilaistumista stimuloivain vaikutuksen vuoksi. Ilmiön tarkkaa mekanismia ei kuitenkaan juuri tunneta. Tämän vuoksi S53P4-, 2-06-, 1-06- ja 3-06-laseista valmistettujen ekstraktien luuerilaistavaa vaikutusta tutkittiin ilman suoraa solu-biomateriaali-kontaktia. Lisäksi lasien aiheuttaman varhaisen luuerilaistumisen mekanismeja liittyen solujen kiinnittymiseen ja kiinnittymisen käynnistämään signalointiin tutkittiin kasvattamalla rasvan kantasoluja S53P4- ja 1-06-bioaktiivisista laseista valmistetuilla levyillä.

BMP-2-stimuloinnin havaittiin aiheuttavan toiminnallisen kanonisen Smad-signalointivasteen kaikilta luovuttajilta peräisin olevissa rasvan kantasoluissa. Tästä huolimatta eri luovuttajien solujen erilaistumisvasteet erosivat merkittävästi toisistaan: toisten luovuttajien solut erilaistuivat BMP-2:n vaikutuksesta luun ja toisten rasvan suuntaan. BMP-2:n aiheuttama soluvaste oli voimakkain ihmisen seerumia sisältävässä mediumissa sekä nisäkässoluissa tuotetulla kasvutekijällä. Mitä tulee lasiekstrakteihin, lasista vapautuneet ionit sekä perinteisesti käytetyt kemialliset luuerilaistustekijät yhdistävä kasvatusliuos aiheutti poikkeuksellisen nopean ja voimakkaan luuerilaistusvasteen rasvan kantasoluissa verrattuna lasi-ionittomaan luuerilaistusmediumiin. Lasiekstrakteista 2-06 ja 3-06 indusoivat luuerilaistumista voimakkaimmin. Ilman luuerilaistusmediumia lasiekstraktit eivät kuitenkaan aiheuttaneet luuerilaistumista. Viljeltäessä S53P4- ja 1-06-biolasilevyillä ilman kemiallisia luuerilaistustekijöitä rasvan kantasolut ilmensivät luuerilaistumisen varhaisia markkereita. Solut kiinnittyivät lasilevyille epätyypillisellä mekanismilla: fokaaliadheesiokohdat olivat pieniä ja tasaisesti ympäri soluja levittäytyneitä, ja aktiinitukiranka oli epäjärjestynyt, mutta tästäkin huolimatta integriiniβ1:n sekä vinkuliinin tuoton havaittiin lisääntyvän lasien vaikutuksesta. Solut myös muokkasivat allaan olevaa biolasipintaa. Bioaktiivisen lasin aiheuttaman varhaisen luuerilaistumisen havaittiin riippuvan fokaaliadheesiokinaasista (FAK) sekä mitogeeniaktivoituvista proteiinikinaaseista (MAPK) ERK1/2 ja JNK. MAPK p38 oli sen sijaan toiminnaltaan merkityksettömämpi.

Yhteenvetona BMP-2:n aiheuttamien soluvasteiden havaittiin olevan voimakkaasti riippuvaisia rasvan kantasolujen luovuttajasta, mutta myös kasvatusmediumin koostumuksesta sekä kasvutekijän tuottoalkuperästä, mikä aiheuttaa haasteita BMP-2:n onnistuneelle kliiniselle käytölle. Kaksijakoisesta erilaistumisvasteesta huolimatta BMP-2:n aiheuttama Smad-signalointi oli yhtenevää kaikissa soluissa, minkä vuoksi myös muiden signalointimekanismien täytyy säädellä BMP-2:n indusoimaa erilaistumisvastetta. Mitä tulee biolasiekstrakteihin, luuerilasitustekijöiden läsnä ollessa lasi-ionien luuerilaistava vaikutus oli poikkeuksellisen voimakas, mikä saattaa tarjota näille mediumeille lukuisia käyttökohteita tehokasta luuerilaistumista edellyttävissä sovelluksissa. Viljeltäessä rasvan kantasoluja biolasilevyillä, solujen huomattiin kiinnittyvän laseille poikkeuksellisella tavalla, ja kiinnittymiseen kytkeytyvän FAK-MAPK–signalointireitin havaittiin olevan merkittävässä asemassa lasien aiheuttaman varhaisen luuerilaistumisen säätelyssä. Nämä havainnot luovat pohjaa bioaktiivisten lasien aiheuttaman solusignalointivasteen tarkemmille analyyseille.

Due to the aging population, the incidence of bone defects, caused either by trauma or disease, is constantly increasing. Bone tissue engineering (TE), combining a biomaterial scaffold, cells and cell growth and differentiation stimulating factors, has recently emerged as a promising approach to treat these defects without the drawbacks associated with the traditionally used bone grafts. With respect to bone TE, adipose stem cells (ASCs) are considered a highly favorable cell choice due to their multipotent differentiation capability and high abundance in the easily obtainable adipose tissue. In fact, bone TE treatments utilizing adipose stem cells have already shown promising results in a number of clinical case studies. However, despite the fast progress of the bone TE approaches, the molecular level cellular responses to the various chemical and biomaterial-elicited stimuli are still poorly understood.

In this thesis, the osteogenic and adipogenic differentiation responses stimulated by bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and bioactive glass (BaG), as well as the underlying intracellular signaling events in human ASCs (hASCs), were evaluated. Accepted also for clinical use, BMP-2 is thought to be a strong bone formation inducer, but based on recent findings, it seems to elicit highly variable cellular responses. To shed light on this, the effect of BMP-2 on osteogenic and adipogenic differentiation, as well as on the canonical Smad signaling pathway was analyzed in hASCs derived from several donors. Moreover, the role of the culture medium (either human serum (HS) or fetal bovine serum (FBS) supplemented) and the production origin of BMP-2 (Escherichia coli or mammalian cells) in the BMP-2 function was evaluated. With respect to the biomaterial component of the bone TE approach, BaGs have been considered highly advantageous due to their inherent ability to stimulate osteogenic differentiation. However, the exact mechanism of this favorable phenomenon is not well known. Thus, the osteogenesis-stimulating effect of ionic extracts from the BaGs S53P4, 2-06, 1-06 and 3-06, in the absence of the cell-biomaterial contact, was determined. Secondly, the mechanisms of BaG-induced early osteogenic differentiation, with respect to cell attachment and attachment-mediated signaling, were evaluated when hASCs were cultured on S53P4 and 1-06 BaG discs.

The stimulation with BMP-2 was observed to elicit functional canonical Smad signaling response in all the hASC donor lines studied. However, with respect to differentiation, hASCs from some donors adopted an osteogenic fate while hASCs from other donors committed towards adipocytes in response to BMP-2. Moreover, the cellular response to BMP-2 was observed to be the strongest in HS condition and with mammalian cells originated BMP-2. With respect to the BaG ionic extracts, the combination of the ions released from the BaGs and the traditionally used osteogenic medium (OM) induced exceptionally fast and extensive osteogenic differentiation of hASCs when compared to the control OM. Of the different BaGs, 2-06 and 3-06 OM extracts seemed to be the strongest stimulators of osteogenic differentiation. As such, however, the BaG extracts could not induce the osteogenic commitment of hASCs. When the hASCs were cultured in contact with the S53P4 and 1-06 discs, the glasses stimulated the early osteogenic differentiation even in the absence of OM. The cell attachment mode on the BaGs was shown to be atypical, with small and dispersed focal adhesion sites and disorganized actin cytoskeleton, but increased production of integrinβ1 and vinculin. The cells also modified the BaG surface underneath them. The BaG-induced early osteogenic differentiation was shown to be highly dependent on focal adhesion kinase (FAK) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and c-Jun N-terminal kinase (JNK), whereas the role of MAPK p38 was less significant.

In conclusion, the BMP-2-induced cellular responses were observed to be highly dependent on the hASC donor but also on culture medium composition and BMP-2 production origin, which poses challenges to the clinical utility of this growth factor. Moreover, despite the varying differentiation responses, the BMP-2-induced Smad signaling was similar in all the hASC donor lines, implying that additional signaling mechanisms must be involved in the BMP-2-induced differentiation. In case of the BaG extracts, the exceptionally strong osteogenesis-inducing ability of the OM-based BaG extracts might be highly applicable in various approaches requiring effective osteogenic differentiation. When cultured in direct contact with the BaGs, a unique cell attachment mode of hASCs was observed and, furthermore, the attachment-related FAK-MAPK signaling pathway was shown to play a central role in the BaG-induced early osteogenic response. These observations set the basis for a more detailed evaluation of the cell signaling events on BaGs, an area with currently only very little knowledge.