The Effect of Embryo Culture Length and Freezing Method on the ART Success Rate and the Weight of the Newborn

Abstract

Kumulatiivinen synnytysprosentti on lapsettomuushoitojen onnistumisen tärkein mittari. Se heijastaa pariskunnan todellista mahdollisuutta saada oma lapsi lapsettomuushoitojen tuloksena. IVF/ICSI-hoitojen tehokkuuteen vaikuttavat mm. munasarjojen optimaalinen stimulaatio, korkeatasoinen alkionviljelylaboratorio pakastusmenetelmineen sekä teknisesti korkeatasoinen ja oikein ajoitettu alkionsiirto. Kumulatiivisen raskausprosentin muodostavat tuoresiirron lisäksi pakastealkionsiirrot. Alkion viljely sekä pakastaminen ja sulattaminen varhaisen alkionkehityksen aikana, altistavat alkion mahdollisesti epigeneettisille muutoksille, joilla voi olla vaikutusta jopa syntyvän lapsen fenotyyppiin.

Tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida alkion viljelyn pituuden sekä käytetyn pakastusmenetelmän (hidas pakastus/vitrifikaatio) vaikutusta kliinisiin raskaustuloksiin, sekä vastasyntyneen painoon. Erityisenä mielenkiinnon kohteena oli tutkia huonolaatuisten jakaantumisvaiheen alkioiden jatkoviljelyn vaikutusta raskaustuloksiin, sekä neljän päivän ikäisten alkioiden käyttöä IVF-hoidoissa. Tutkimuksien potilasmateriaali on kerätty ajanjaksolta 1.1.2008-31.12.2014. Tampereen yliopistollisen sairaalan lapsettomuusklinikka osti tutkimusajanjaksolla IVF-laboratoriopalvelut Hedelmöitysklinikka Ovumialta. Lisäksi tutkimuksessa on mukana potilaita Tampereen ja Helsingin Fertinovasta sekä Karolinska sjukhuset Huddingen lapsettomuuspoliklinikalta. Kyseessä on retrospektiivinen kliininen tutkimus joka koostuu neljästä osatyöstä (I-IV).

604 IVF/ICSI syklistä valittiin jatkoviljelyyn huonolaatuiset jakaantumisvaiheen alkiot (n=1879), jotka eivät olleet siirtokelpoisia eivätkä pakastuskelpoisia tuoresiirtopäivänä. 193 syklistä 32%:ssa ainakin yksi alkio kehittyi hyvälaatuiseksi blastokystaksi ja pakastettiin. Näiden blastokystien siirroista 17.2% on tähän mennessä johtanut synnytykseen ja nämä ”ylimääräiset” synnytykset nostivat kumulatiivisen synnytysprosentin 43%:sta 47%:iin. Laskelmien mukaan 53 uutta IVF/ICSI sykliä pystyttiin välttämään käyttämällä näitä jatkoviljeltyjä alkioita, jotka muuten olisi tuhottu (I).

Tuoreiden (n=360) ja pakastettujen (n=216) päivän 4 alkioiden siirrot johtivat vähintään yhtä hyviin raskaustuloksiin verrattuna päivän 3 (n= 1371/635) ja päivän 5 (n=326/654) alkionsiirtoihin. Niiden alkioiden siirrot, jotka saavuttivat varhaisen blastokystavaiheen jo päivänä 4, johtivat korkeimpaan synnytysprosenttiin ja alhaisimpaan keskenmenoprosenttiin (47.4% ja 6.7%). IV.

Tutkiaksemme alkionviljelyn pituuden vaikutusta lapsen syntymäpainoon, vertasimme 142:sta tuore- ja 135:sta pakasteblastokystasiirrosta syntyneiden täysiaikaisten yksöslasten painoa samalla raskausviikolla syntyneisiin, samaa sukupuolta oleviin, päivän 2-3 alkioista syntyneisiin lapsiin. Tuoreista blastokystistä syntyneet lapset olivat painavampia kuin jakaantumisvaiheen alkioista syntyneet (painoero 111.8g, p=0.047). Viiden ja kuuden päivän ikäisistä alkioista syntyneistä lapsista 4.9% kasvoi 95:n persentiilin käyrän yläpuolella kun taas vain 1,4% jakaantumisvaiheen alkioista syntyneistä lapsista kasvoi käyrän yläpuolella. Kun analyysissä huomioitiin lasten sukupuolet, jäi painoero merkittäväksi vain pojilla (painoero blastokystapoikien ja päivän 2-3 alkioista syntyneiden poikien välillä 195.2g, p=0.023, tyttöjen välillä 37.2g) (II). Pakastusmenetelmä ei näyttänyt merkittävästi vaikuttavan syntymäpainoon. Sulatuksen jälkeen vitrifioiduista alkioista oli käyttökelpoisia 88.4% ja hitaasti pakastetuista 67.7% (p<0.001). Yhden synnytyksen aikaansaamiseksi piti sulattaa 7.4 vitrifioitua alkiota, kun hitaasti pakastettuja piti sulattaa 11.9 (III).

Tutkimus osoittaa että kumulatiivinen synnytysprosentti nousee ja uusia hoitoja voidaan välttää siirtämällä jatkoviljeltyjä alun perin huonolaatuisia jakaantumisvaiheen alkioita, jotka muuten olisi tuhottu. Neljän päivän ikäisten alkioiden käyttö johtaa hyviin kliinisiin raskaustuloksiin ja niiden käyttöä tulisi harkita laajemminkin. Tarvitaan kuitenkin satunnaistettu, kontrolloitu tutkimus suuremmalla aineistolla tulosten varmistamiseksi. Aikaisemmissa tutkimuksissa on huomattu blastokystaviljelyn aiheuttavan suuren syntymäpainon lisääntymistä vastasyntyneillä. Tutkimuksessamme havaitsimme, että pitkä alkionviljely vaikuttaa johtavan suurempaan keskimääräiseen syntymäpainoon pojilla, mutta ei tytöillä. Jakaantumisvaiheen alkioiden pakastaminen vitrifioimalla näyttää johtavan korkeampaan sulatuksesta selvinneiden osuuteen kuin hitaalla pakastuksella. Vähemmän alkioita tarvitsee sulattaa yhtä synnytystä kohden vitrifikaatioryhmässä verrattuna hitaasti pakastettuihin.

The true indicator of assisted reproductive technology (ART) success is the cumulative live birth rate, reflecting the real chance of a couple to parent a child. The efficacy of IVF/ICSI treatments depends on an optimal ovarian stimulation, a high quality embryo culture and cryopreservation, and a skilled embryo transfer. Both the fresh embryo transfer and the subsequent frozen-thawed embryo transfers contribute to the result. The time period of early embryo development is characterized by intense epigenetic reprogramming. An embryo culture and cryopreservation during the early embryo development may predispose the embryo to epigenetic changes possibly affecting the phenotype.

The aim of the present study was to assess the effect of the embryo culture length and the type of cryopreservation (slow freezing/vitrification) on the clinical outcomes and on the weight of the newborn. The special interests were to evaluate the value of the extended culture of poor quality cleavage stage embryos and the use of Day 4 embryos.

The study design is a retrospective cohort study and the research material was collected from medical records over the period of 1.1.2008-31.12.2014. The IVF-laboratory work was produced by the Infertility clinic Ovumia during the study period. Additionally, in the study there are patients from the Infertility Clinic Fertinova (Tampere and Helsinki) and Infertility Clinic of Karolinska Hospital Huddinge, Stockholm, Sweden.

From 604 IVF/ICSI cycles 1879 poor quality cleavage stage embryos not eligible for transfer or cryopreservation were cultured until Day 5 or 6 (I). In 193 cycles (32%), at least one blastocyst stage embryo could be vitrified. The transfer of these blastocysts (n=134) has so far led to a delivery rate of 17.2%, increasing the cumulative delivery rate from 43% to 47%. Fifty-three repetitive IVF/ICSI cycles were estimated to be avoided (I).

The clinical outcomes of fresh (n=360) and vitrified-warmed (n=216) Day 4 embryo transfers compared to Day 3 (n=1371/635) and Day 5 (n=326/654) embryo transfers appeared to generate at least comparable clinical results. The embryos reaching the early blastocyst stage by Day 4 were associated with the highest live birth rate and the lowest miscarriage rate (47.4% and 6.7%), compared to the slower developing Day 4 embryos (19.4% and 15.4%) (IV).

To survey the effect of the IVF culture length on the birth weight, altogether 142 fresh and 135 frozen-thawed (FET) blastocyst transfers leading to a singleton live full-term delivery were compared with Day 2-3 transfers matched with a newborn of same sex and gestational weeks. The weight of the babies born from fresh blastocysts was higher than controls (the mean weight difference 111.8gr, p= 0.047), 4.9% of cases and 1.4% of controls being large for gestational age. When the gender of the baby was considered, the difference remained only in boys (weight difference between fresh blastocyst boys and cleavage stage boys 195.2g, p=0.023) but not in girls (weight difference 37.2g) (II). The freezing method did not seem to influence the birth weight. The post-thaw viability of the vitrified embryos was significantly higher than that of the slow frozen embryos (88.4% vs. 67.7% p<0.001). 7.4 vitrified embryos were needed to be thawed to produce one delivery while in the slow freezing group the number was 11.9 (III).

This study shows that the cumulative delivery rate can be increased, and repetitive IVF/CSI treatments avoided by using the blastocysts developing from poor-quality cleavage stage embryos, which otherwise would have been discarded. The Day 4 embryo transfers produced good clinical outcomes and should be considered for wider utilization in IVF-clinics. However, a randomized controlled study with a larger study material is needed to verify the results. In some previous studies, the incidence of large for gestational age (LGA) babies has been increased after blastocyst stage transfers. The novel finding of the study II was the increased birth weight after blastocyst culture among boys but not among girls. Vitrification of cleavage stage embryos seems to be associated with a higher survival rate and a lower miscarriage rate compared to slow freezing.