TRPA1 in Inflammation

Abstract

Tulehdus on elimistön suojamekanismi ulkoisia taudinaiheuttajia vastaan. Sen tarkoituksena on poistaa uhkaava tekijä sekä palauttaa kohde-elimen ja elimistön tasapaino. Tulehdusreaktion oireita ovat punoitus, kuumotus, turvotus ja kipu. Immuunijärjestelmä pyrkii kohdentamaan tulehdusreaktion oikeisiin kohteisiin sopivissa mittasuhteissa, mutta häiriintyessään tulehdusreaktio voi olla elimistölle haitallinen ja johtaa tulehdustautien syntyyn. Globaalisti tulehdukselliset sairaudet aiheuttavat nykyhoidoista huolimatta paljon inhimillistä kärsimystä ja terveydenhuollon kustannuksia ja siksi niiden tutkimus parempien hoitojen kehittämiseksi on oleellisen tärkeää.

Transient receptor potential ankyriini 1 (TRPA1) kuuluu TRP-ionikanava-perheeseen yhdessä yli 30 muun proteiinin kanssa. TRPA1 sijaitsee solukalvolla ja aktivoituessaan päästää soluun pääasiassa Ca2+-ioneja. TRPA1 ilmenee hermosolujen aistinpäätteissä ja sen fysiologinen tehtävä on aistia elimistölle haitallisia kemiallisia ärsykkeitä ja varoittaa niistä tuottamalla kipua. TRPA1:n aktivaatio välittää myös tulehdukseen liittyvää turvotusta sekä herkistymistä kivulle. Uudet tutkimustulokset osoittavat, että ärsyttävien kemikaalien lisäksi TRPA1 aktivoituu myös joidenkin tulehduksessa syntyvien molekyylien, kuten happi- ja typpiradikaalien, vaikutuksesta. Toisaalta on todettu, että myös eräät muut solutyypit kuin hermosolut ilmentävät TRPA1:tä. Siten on teoriassa mahdollista, että TRPA1:n aktivaatio olisi yleinen tulehdusta voimistava mekanismi. Tämän väitöskirjan osatöissä tutkimme TRPA1:n aktivaation roolia kokeellisesti neljän eri tulehdustaudin mallissa.

Ensimmäisessä osatyössä (I) tutkimme TRPA1:n aktivaation osuutta karrageeni-tulehduksessa. Tämä eläinkoe on akuutin tulehduksen yleinen koemalli mm. seulottaessa uusia anti-inflammatorisia lääkkeitä. Tulostemme mukaan karrageenin laukaisema akuutti tulehduksellinen tassuturvotus oli lievempi TRPA1:n estäjällä hoidetuilla sekä TRPA1-poistogeenisillä hiirillä. TRPA1:n vaikutus oli kytkeytynyt prostaglandiinituotantoon, sillä syklo-oksygenaasientsyymin estäminen vaimensi merkittävästi myös suoran TRPA1:n aktivaattorin laukaisemaa turvotusvastetta.

Toisessa osatyössä (II) tutkittiin TRPA1:n merkitystä kolmessa kihtiä kuvaavassa eläinmallissa. Uraattikiteiden laukaisema turvotus, nivelkipu ja tulehdussytokiinien tuotto väheni merkittävästi TRPA1:n aktivaation estävällä lääkehoidolla sekä oli alentunut TRPA1-poistogeenisissä hiirissä.

Nivelrikon ja TRPA1:n välistä yhteyttä tutkittiin kolmannessa osatyössä (III). Natriumjodoasetaatin (engl. monosodium iodoacetate, MIA) laukaisema nivelrikon koe-eläinmalli on laajasti käytetty tutkimusmenetelmä, jossa MIA aiheuttaa ensin akuutin tulehduksen ja tämä johtaa nivelruston vaurioon ja kipuun. Tuloksemme osoittavat, että MIA:n laukaisema tulehdus on ainakin osittain TRPA1-välitteinen sekä in vitro että in vivo ja että nivelrikkomuutosten sekä nivelkivun kehittyminen on vähentynyt TRPA1-poistogeenisissä hiirissä.

Neljännessä osatyössä (IV) tutkimme TRPA1:n osuutta akuutissa allergisessa tulehduksessa. Tutkimusasetelmassa koe-eläimet herkistettiin allergeenille ja varsinaisissa kokeissa tutkimme allergeenialtistuksen käynnistämää tulehdusvastetta. TRPA1:n estäminen lääkkeellä ja ionikanavan geneettinen vaimentaminen lievittivät selvästi allergista tulehdusta: havaitsimme, että alkuvaiheen paikallinen turvotusvaste ja tulehdussytokiini IL-4:n tuotto vähenivät. Vuorokauden kuluttua tulehdusreaktio oli vaimeampi TRPA1:n estäjällä hoidetuilla sekä TRPA1-poistogeenisillä hiirillä, mistä osoituksena eosinofiilien kertyminen tulehdusalueelle oli vähentynyt. TRPA1- poistogeenisten hiirten pernan lymfosyyttien vaste allergeenille oli samanlainen kuin vastaavilla villityypin hiirillä. Tämä viittaa siihen, että TRPA1 ei vaikuta allergisoitumiseen vaan nimenomaan allergeenin aiheuttamaan tulehdusreaktioon.

Koska TRPA1:n aktivaation estäminen osoittautui tehokkaaksi keinoksi hoitaa akuuttia tulehdusta tutkimissamme tautimalleissa, pyrimme identifioimaan uusia TRPA1:n aktivaatiota estäviä molekyylejä. Aikaisempien seulontatutkimustemme perusteella selvitimme pinosylviinin tehoa TRPA1:n estäjänä (osatyö V). Pinosylviini esti TRPA1:n välittämiä vasteita sekä solu- että eläinkokeissa. Tulos antaa pohjaa tulevaisuuden lääkekehitykselle.

Tämän väitöskirjan tutkimustulokset tuovat uutta tärkeää tietoa TRPA1:n merkityksestä tulehdusreaktiota ja siihen liittyvää kipua voimistavana mekanismina, joka aktivoituu endogeenisten välittäjäaineiden vaikutuksesta. Nämä löydökset laajentavat merkittävästi vallitsevaa käsitystä TRPA1-ionikanavan merkityksestä ihmisen patofysiologiassa ja avaavat uusia mahdollisuuksia lääkehoidon kehittämiseen: TRPA1:n estäminen on lupaava uusi strategia lievittää tulehduksellisiin sairauksiin liittyvää tulehdusreaktiota sekä kipua.

Inflammation is part of the host defence mechanisms meant to protect the host from invading pathogens such as bacteria, viruses and parasites and to restore tissue and system homeostasis. Inflammation evokes symptoms like local pain, edema, and redness especially in the acute phase, but the reaction may continue and turn into a chronic state, capable of leading to irreversible changes followed by a loss-of-function. Sometimes, the regulation and targeting of inflammation is inappropriate and may prove harmful to the host. Inflammatory diseases are responsible for much human suffering and pose a major economic burden. Therefore, better treatment methods for inflammation are sought continuously.

Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) is a member of the large family of TRP ion channels. The ligand gated and membrane bound TRPA1 is permeable to ions, predominantly to Ca2+. Initially TRPA1 was found to mediate nociception in sensory nerves and serve as a chemosensor for potentially harmful exogenous compounds, but later the understanding has expanded. In addition to mediating pain, the activation of TRPA1 has been associated with inflammatory hyperalgesia, allodynia and extravasation. Unexpected ligands for TRPA1 have been discovered, as many inflammation associated endogenous factors such as reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) have been proven to activate TRPA1. Therefore, the role of TRPA1 might not be limited to chemosensation of exogenous irritants. The present studies utilized four experimental inflammatory disease models to clarify the potential proinflammatory role of TRPA1 activation.

The first study (I) revealed the crucial role of TRPA1 in the carrageenan-induced acute murine paw edema model, which is a general model of robust acute inflammation used widely in screening for anti-inflammatory drugs. Pharmacological inhibition and genetic depletion of TRPA1 attenuated the development of carrageenan-induced paw edema. Furthermore, TRPA1-mediated edema was linked to prostaglandin production, as the cyclooxygenase (COX) inhibitor ibuprofen was able to block the inflammatory edema induced by direct TRPA1 activation.

Gout flare is a condition associated with severe joint pain and acute inflammation and it was hypothetized that TRPA1 could be involved in this reaction. The second study (II) investigated whether experimental murine gout would be enhanced by TRPA1 activation. Interestingly, it was found in several in vivo tests i.e. acute paw edema model, experimental gouty knee arthritis and the air-pouch inflammation test that inflammatory edema, arthritic pain and the production of proinflammatory cytokines in response to an injection of monosodium urate crystals were diminished by pharmacological inhibition and genetic depletion of TRPA1.

The putative relationship between osteoarthritis and TRPA1 was examined in the third study (III) based on the findings obtained with the monosodium iodoacetate (MIA) induced arthritis, a widely used experimental model of osteoarthritis. This model begins with an acute inflammatory phase which proceeds to degradation of articular cartilage and joint pain. The inhibition of TRPA1 both in vivo and in vitro exerted an anti-inflammatory effect in the acute setting and the longer evaluation of the test animals revealed alleviated joint pain and less severe cartilage degradation in TRPA1 deficient mice.

The fourth study (IV) evaluated the role of TRPA1 in acute allergic inflammation. Treating the studied mice with a TRPA1 blocker alleviated the acute allergic response induced by a specific allergen and the phenomenon duplicated in TRPA1 deficient mice. The effect was seen early in the acute allergic inflammation as less tissue edema and reduced production of the proinflammatory cytokine IL-4 and further as a decreased recruitment of eosinophils to the site of the inflammation. Importantly, genetic depletion of TRPA1 did not impair the splenocytes’ response to the allergen proposing an unaltered sensitization.

As TRPA1 seemed a promising target to inhibit to alleviate acute inflammation and inflammatory pain, the fifth study (V) aimed at identifying a novel TRPA1 blocker. The stilbenoid pinosylvin was found to be a potent blocker of TRPA1-induced responses both in vitro and in vivo and therefore could serve as a basis for the development of new TRPA1 inhibiting drugs.

The present studies have produced valuable novel information on the proinflammatory role of TRPA1. The findings expand our understanding of the TRPA1 ion channel; it is no longer simply a nociceptor and chemosensor for potentially harmful exogenous compounds, instead it is a significant endogenous mechanism mediating and regulating inflammation and inflammatory pain in several disease states. The findings propose novel properties of TRPA1 in human pathophysiology and open new avenues for the treatment of inflammation and inflammatory pain through inhibition of TRPA1.