Ageing-associated changes in gene expression and DNA methylation with implications for intergenerational epigenetic inheritance

Abstract

Vanheneminen on solujen ja kudosten rakenteen ja toiminnan heikkenemistä, joka johtaa toimintakyvyn vajauksiin, sairastuvuuden lisääntymiseen ja lopulta kuolemaan. Vanhenemiseen liittyvien haitallisten muutosten taustalla ajatellaan olevan muutokset solu- ja molekyylitasolla, muun muassa geenien ilmenemisessä ja sitä säätelevissä epigeneettisissä mekanismeissa, kuten DNA:n metylaatiossa. Sekä proteiineja koodaavien geenien että muiden RNA-molekyylien ilmenemisessä tapahtuu muutoksia. DNA metylaation tiedetään vähenevän globaalisti (hypometylaatio) ja toisaalta lisääntyvän tietyillä promoottorialueilla (hypermetylaatio).

Tämän tutkimuksen tarkoitus oli tunnistaa ikääntymiseen liittyviä geeni-ilmenemisen muutoksia 90-vuotiailla (I), tunnistaa ikääntymiseen liittyviä DNA:n metylaation muutoksia 90-vuotiailla ja selvittää kuinka ne ovat yhteydessä geeni-ilmenemisen tasoon (II), tunnistaa ikääntymiseen liittyviä DNA:n metylaation muutoksia keski-ikäisessä väestössä (III) ja kartoittaa vanhempien eliniän mahdolliset vaikutukset jälkeläisten DNA:n metylaatioprofiiliin (IV).

Tutkimukset toteutettiin kahdessa aineistossa: Tervaskannot 90+ (I, II & IV) ja Lasten ja Nuorten Sepelvaltimotaudin riskitekijät (III). Näytteistä määritettiin geeni-ilmenemisen taso veren mononukleaarisista valkosoluista (I), DNA:n metylaatioaste samoista soluista (II & IV) tai DNA:n metylaatioaste kokoverestä (III) kaupallisilla sirutekniikoilla. Geeni-ilmeneminen määritettiin Illuminan HumanHT12 v4 BeadChip:llä ja DNA:n metylaatio Illuminan Infinium HumanMethylation450 BeadChip:llä. Tulokset analysoitiin pääasiassa R-ohjelmointikielellä sekä SPSS- ja Chipster-ohjelmistoilla. Lisäksi käytettiin GO-termejä ja erilaisia signalointireittejä tunnistavia bioinformaattisia työkaluja.

Tuloksemme osoittavat, että vanhenemiseen liittyvät geeni-ilmenemisen muutokset poikkeavat toisistaan naisten ja miesten välillä. Nämä muutokset liittyivät pääasiassa immuunijärjestelmän toimintaan (I). Tunnistamamme ikääntymiseen liittyvät DNA:n metylaation muutokset (II) eivät jakaudu tasaisesti ympäri genomia, vaan iän myötä hypermetyloituneet kohdat keskittyvät CpG-saariin ja lähelle transkription aloituskohtia. Lisäksi geenit, joissa iän myötä tapahtuu hyper- tai hypometylaatiota, poikkeavat toisistaan. Hypermetyloituneet geenit liittyvät DNA:han sitoutumiseen ja transkription aloitukseen sekä kasvuun ja kehitykseen, kun taas iän myötä hypometyloituvat geenit eivät muodosta yhtenäistä ryhmää. Voidaan olettaa että hyper- ja hypometylaatioon johtavat tapahtumat ovat erilaisia ja siten myös näiden prosessien seuraukset poikkeavat toisistaan. Huomionarvoista oli, että vanhenemismuutokset 90-vuotialla ja keski-ikäisillä olivat suurelta osin samansuuntaisia ja samoihin prosesseihin keskittyneitä (II & III). Tuloksemme osoittavat myös, että vanhenemiseen liittyvien DNA:n metylaation muutosten yhteys geeni-ilmenemisen tasoon on heikko (I & II). Neljännessä osatyössä tunnistettiin joukko metylaatiokohtia, joissa metylaatioaste on yhteydessä isän eliniän pituuteen vielä 90-vuotiaanakin. Nämä metylaatiokohdat sijaitsivat pääasiassa CpG-saarien ulkopuolella. Geenit, joiden alueella nämä muutokset sijaitsivat, liittyivät solusignalointiin sekä kasvuun ja kehitykseen (IV).

Tuloksemme vahvistavat, että ikääntymiseen liittyy muutoksia immuunijärjestelmässä ja että sekä immuunijärjestelmän toiminta että vanheneminen poikkeavat toisistaan sukupuolten välillä. DNA:n metylaatiota koskevat tuloksemme vahvistavat aiempia havaintoja. Huomionarvoista on vanhenemiseen liittyvien epigeneettisten muutosten monipuolisuus ja monimutkaisuus. Tuloksissamme myös osoitetaan ensimmäistä kertaa vanhemman koko elinkaareen pituuden merkitys jälkeläisen DNA:n metylaatioprofiiliin. Ikääntymiseen liittyvä hyper- ja hypometylaatio poikkeavat selvästi sekä toiminnaltaan että sijainniltaan. Esitämme, että ikääntymiseen liittyvä hypermetylaatio on säädellyn prosessin tulosta, kun taas hypometylaation taustalla vaikuttavat ympäristötekijät ja sattuma. Kasvua ja kehitystä säätelevissä geeneissä tunnistettiin sekä ikääntymiseen että isän elinikään liittyviä muutoksia DNA:n metylaatiossa. Nämä löydökset tukevat vanhenemisen hyperfunktio-teoriaa.

Ageing can be defined as the decreasing functionality and compromised homeostasis of cells and tissues, leading to decreased functionality, increased morbidity and, eventually, to death. The detrimental phenotypic changes associated with ageing are believed to be due to changes at the molecular level, including changes in gene expression and in epigenetic mechanisms, such as DNA methylation. The expression of protein coding genes as well as non-coding RNAs (ncRNAs) is affected, and both global hypomethylation and promoter-specific hypermethylation are known to occur.

The aims of this study were to identify ageing-associated gene expression changes in nonagenarians (I), to identify ageing-associated DNA methylation changes in nonagenarians and to analyse how these changes are associated with the level of gene expression (II), to identify ageing-associated DNA methylation changes in middle-aged individuals (III) and to investigate whether parental lifespan manifests itself in the DNA methylation profile of progeny (IV).

The studies were conducted in two populations, namely, the Vitality 90+ (I, II & IV) and the Young Finns Study (III). Using commercial array techniques, we analysed gene expression levels using peripheral blood mononuclear cells (I) and the DNA methylation level from the same cells (II & IV) or from whole blood (III). Gene expression was analysed with Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip, and DNA methylation was analysed with Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. The data were primarily analysed with the R programming language as well as SPSS and Chipster software. In addition, bioinformatic tools were used to identify enriched GO terms and canonical pathways.

Our results indicate that the ageing-associated changes in gene expression differ between males and females. Genes where the level of expression was associated with age were associated primarily with immune system functions (I). CpG sites differentially methylated with age in our study (II) were unequally distributed across the genome, with hypermethylation being enriched in CpG-islands (CGIs) and regions adjacent to transcription start sites (TSSs). The identified ageing-associated hyper- and hypomethylation differ also in terms of associated genes; hypermethylated genes were associated with development and morphogenesis as well as DNA binding and transcription, whereas hypomethylated genes did not cluster to any specific process. That hyper- and hypomethylation differ in terms of location and associated genes during ageing implies that the causes and consequences of these processes also differ. The results that were obtained from nonagenarians (II) and from middle-aged population (III) were highly similar. The association between identified ageing-associated DNA methylation changes and gene expression in nonagenarians was poor (I & II). In the last study, we identified DNA methylation sites where the methylation level is associated with paternal lifespan even at the age of 90. These sites were primarily located outside of CGIs, and the genes harbouring these sites were associated with cell signalling as well as development and morphogenesis (IV).

Our results further confirm the role of immune system changes and sexual dimorphism in the ageing process. The results of DNA methylation analysis support previously reported findings and underline the complex nature of ageing-associated epigenetic changes. These results are also the first to show that the entire parental lifespan affects the DNA methylation profile of the progeny. As ageing-associated hyper- and hypomethylation show distinct features, we propose that ageing-associated hypermethylation is due to programmed changes, whereas ageing-associated hypomethylation appears to be due to environmental and stochastic effects. Methylation changes in genes associated with developmental processes were identified to be associated with both ageing and paternal lifespan, supporting the hyperfunction theory of ageing.