Identification of 1p21-22 Amplification in Bladder Cancer and Expression of non-coding RNAs in Prostate Cancer

Abstract

Eturauhas- ja rakkosyövän molekyylimekanismit

Syöpä on monimutkainen sairaus, jonka aiheuttavat normaaliin soluun kertyvät geneettiset muutokset. Tällaiset geneettiset muutokset häiritsevät normaalien solujen homeostaasia ja johtavat hallitsemattomaan solujen lisääntymiseen. Näiden muutosten tunteminen on tärkeää, jotta voitaisiin kehittää entistä tehokkaampia syövän hoitomuotoja ja diagnostisia menetelmiä tappavan tautimuodon tunnistamiseksi.

Virtsarakon syöpä on yleisin virtsateiden maligniteetti. Useimmat virtsarakon syövät syntyvät välimuotoisesta epiteelistä (uroteliaaliset karsinoomat). Alle 5 % virtsarakon syöpätapauksista on levyepiteeliperäisiä. Virtsarakon syöpä on heterogeeninen sairaus, jolle ovat ominaisia erilaiset geneettiset muutokset, jotka johtavat eri polkuja syövän kehittymiseen ja etenemiseen. Monet näistä geneettisistä muutoksista vaikuttavat geenien kopiolukumäärään johtaen onkogeenien monistumaan ja kasvurajoitegeenien häviämään.

Tässä tutkimuksessa käytettiin sirupohjaista, vertailevaa genomista hybridisaatiomenetelmää (aCGH) geenikopiolukumäärän analysoimiseksi kliinisissä rakkosyöpänäytteissä sekä solulinjoissa. Yhdeksi uudeksi monistuma-alueeksi tunnistettiin kromosomialue 1p21-22. Työssä kartoitettiin ko. aluetta tarkemmin ja osoitettiin, että ns. minimaalinen monistuma-alue käsitti yhden miljoonan emäsparin DNA-jakson sisältäen yhteensä 11 tunnettua geeniä. Korkein monistuma-aste löytyi SCaBER-levyepiteelisyöpäsolulinjasta. Näistä neljä geeniä, TMED5, DR1, RPL5 ja EVI5, yli-ilmeni SCaBER-solulinjassa, DR1 kaikkein eniten. Julkisten tietokantojen perusteella DR1 yli-ilmenee myös kliinisissä näytteissä, jotka edustavat yleistä virtsarakkosyövän histologista tyyppiä.

Eturauhassyöpä on miesten toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä maailmassa ja yleisin kehittyneissä maissa. Taudin histologisen ja kliinisen käyttäytymisen monimuotoisuuden taustalla olevia mekanismeja tunnetaan huonosti. Eturauhassyövän molekyylitason mekanismien tunteminen mahdollistaisi uusien taudin aggressiivisuutta kuvastavien biomarkkerien löytämisen.

Viime aikoina on yhä enemmän kiinnitetty huomiota mikroRNA:iden (miRNA) merkitykseen syövän kehittymisessä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA-ilmentymistasot ovat muuntuneita eturauhassyövässä. Onkin mahdollista, että niitä voitaisiin käyttää ennusteellisina biomarkkereina. Kuten muissa syövissä, on epäselvää, koostuuko eturauhassyöpä eri solupopulaatioista, joilla on erilainen jakaantumiskyky, kuten syövän kantasolumallit ennustavat. Useissa tutkimuksissa on käytetty virtaussytometriaa eturauhasen kantasolujen eristämiseen. Tässä tutkimuksessa tehtiin genominlaajuinen miRNA-ilmentymisen analyysi potilaista peräisin olevista kantasolun kaltaisista soluista (SC), välivaiheen soluista ja sitoutuneista (CB) soluista. Jokainen solualapopulaatio poikkesi toisistaan miRNA-ilmentymisprofiililtaan riippumatta siitä, oliko kyseessä syöpänäyte vai ei. MiR-548c-3p:n havaittiin yli-ilmentyvän noin viisinkertaisesti SC-soluissa verrattuna CB-soluihin. Toiminnallisissa tutkimuksissa miR-548c-3p:n yli-ilmentyminen CB-soluissa vähensi erilaistumista kohti kantasoluilmiasua. MiR-548c-3p oli myös merkittävästi yli-ilmentynyt kastraatioresistentistä eturauhassyövästä (CRPC) eristetyissä soluissa verrattuna eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta (BPH) eristettyihin epiteelisoluihin. Tämä viitaa siihen, että miR-548c-3p voisi olla eturauhassyövän aggressiivisuuden biomarkkeri.

Tunnistaaksemme uusia, eri tavoin ilmentyviä miRNA:ita, syväsekvensoimme joukon kliinisiä eturauhassyöpänäytteitä. MiR-1247-5p, miR-1249, miR-1269a, miR1271-5p, miR-1290, miR-1291 ja miR-1299 ilmentyivät eri lailla syövässä ja normaalissa eturauhasessa. Niinpä näitä tutkittiin laajemmassa materiaalissa qRT-PCR-menetelmällä. MiR-1247-5p ilmentyi merkittävästi enemmän CRPC-näytteissä verrattuna ei-maligniin eturauhaseen. Ennusteohjelmien perusteella miR-1247-5p:n yksi kohdegeeni voisi olla MYCBP2 (myc:iä sitova proteiini 2). miR-1247-5p:n yli-ilmentyminen PC-3- ja LNCaP-syöpäsolulinjoissa johti MYCBP2:n ilmentymisen laskuun sekä mRNA- että proteiinitasolla. Lusiferaasireportterikoe vahvisti, että MYCBP2 on miR-1247-5p:n kohde. Useissa uuden sukupolven sekvensointitutkimuksissa on syövissä löydetty uusia ryhmiä ei-koodaavia RNA:ita. Eturauhassyöpäsolulinjoissa miRNA:iden jälkeen toiseksi yleisin ryhmä ei-koodaavia RNA:ita ovat tRNA:ista peräisin olevat fragmentit (tRFs). Niiden ominaisuudet, runsas ilmentyminen ja tarkka sekvenssi viittaavat siihen, että nämä molekyylit eivät ole satunnaisia tuotteita tRNA:n hajoamisesta. tRF:ien tarkka rooli on kuitenkin edelleen epäselvä. Tässä tutkimuksessa tRF:ien ilmentymistä analysoitiin potilaan kudosnäytteistä. Tutkimuksessa tunnistettiin yhteensä 598 erilaista tRF:ää, jotka näyttivät ilmentyvän eri lailla syövässä kuin normaalissa kudoksessa. Suurin osa tunnistetuista tRF:ista on peräisin kypsän sytosolisen tRNA:n 5’-ja 3’-päistä, mutta myös muita fragmentteja löytyi. 5’-päästä peräisin olevat tRF:t olivat eniten yli-ilmentyneitä ja 3’-päästä peräsin olevat ali-ilmentyneitä syövässä. Kolmen tRF:n ilmentymiserot varmennettiin qRT-PCR:llä. Normalisoitu tRNALys:stä ja tRNAPhe:stä peräisin olevien tRF-315:n ja tRF-544:n ilmentyvyyssuhde ennusti hyvin taudin etenemistä.

Yhteenvetona tutkimuksessa löydettiin uusi monistuma-alue, jossa saattaa sijaita rakkosyövän kehityksen kannalta tärkeitä onkogeenejä. Lisäksi tunnistettiin useita eturauhassyövässä poikkeavasti ilmentyviä ns. ei-koodaavia RNA:ita. Nämä saattavat olla mekanistisesti tärkeitä eturauhassyövän kehityksen kannalta ja mahdollisia syövän aggressiivisuuden markkereita.

Cancer is a complex disease, caused by accumulation of genetic alterations in normal cells. The consequence of these genetic alterations is the disruption of normal cell number homeostasis and uncontrolled cell proliferation. Understanding the molecular mechanisms behind tumorigenesis is essential in order to identify aggressive and possibly lethal form of the disease as well as to plan effective cancer therapeutic strategies.

Urinary bladder cancer is the most common malignancy of the urinary tract. Most of the tumors arise from the epithelium lining the inside of the urinary bladder (urothelial carcinomas). Squamous cell carcinomas represent less than 5% of bladder cancer cases. Bladder cancer is a heterogeneous disease, characterized by different genetic alterations, leading to diverse pathways of cancer development and progression. Many of these genetic alterations consist of region-specific gains and losses of DNA copy number. Regions of DNA copy number gain or amplification commonly harbor oncogenes, whereas deleted regions harbor tumor suppressor genes.

In this study, array-comparative genomic hybridization (aCGH) was performed in bladder cancer clinical samples and cell line models, revealing a common amplification at chromosomal region 1p21-22. The minimal region of the amplification was mapped to a region of about one Mb in size, containing a total of 11 known genes. The highest amplification was found in SCaBER squamous cell carcinoma cell line. Four genes, TMED5, DR1, RPL5 and EVI5, showed significant overexpression in the SCaBER cell line compared to all the other samples tested. DR1 was found to be the most significantly overexpressed in the SCaBER cell line. According to published clinical sample cohorts, DR1 is overexpressed also in superficial and infiltrating bladder cancers.

Prostate cancer (PC) is the second most commonly diagnosed cancer among males worldwide and the most frequently diagnosed malignancy in developed countries. The heterogeneity of histologic and clinical features of PC is well known, but the mechanisms underlying the heterogeneity are not understood. Deeper understanding of the molecular mechanisms of PC tumorigenesis is needed to discover more specific biomarkers of aggressive form of the disease.

Recently, there has been increasing attention on the role of microRNAs (miRNAs) in cancer development. Several expression-profiling studies have provided evidence of aberrant expression of miRNAs in prostate cancer and have highlighted the potential use of specific miRNA expression signatures as prognostic or predictive markers.

Similarly to other solid tumors, it is at present unclear whether prostate cancer is organized hierarchically into populations of cells with different proliferative potentials, as cancer stem cell (CSC) model suggests. Several studies have used flow cytometry-based approaches to isolate putative prostate stem cells. Here, genome-wide miRNA expression analysis was performed on patient-derived, stem-like cells (SC), transit-amplifying cells and committed basal (CB) cells, enriched from briefly cultured primary prostate epithelial cells. Each cell subpopulation showed a distinct miRNA expression profile, regardless of its pathologic status. MiR-548c-3p was found to be overexpressed approximately fivefold in SCs, compared with CBs. Functional studies of miR-548c-3p overexpression in CBs showed increased dedifferentiation to a more stem-like phenotype. MiR-548c-3p was also found to be significantly upregulated in CRPC-derived epithelial cells, compared with BPH-derived epithelial cells, suggesting that miR-548c-3p is a functional biomarker for PC aggressiveness. In order to identify new, differentially expressed miRNAs, the expression data obtained from recent deep-sequencing experiments on pools of clinical specimens were analyzed. MiR-1247-5p, miR-1249, miR-1269a, miR1271-5p, miR-1290, miR-1291 and miR-1299 showed differential expression in malignant samples, compared to benign ones and were selected for validation by qRT-PCR.

Significant up-regulation of miR-1247-5p was found in castration-resistant prostate cancer (CRPC), compared to non-malignant prostate. The expression of miR-1247-5p was subsequently studied in PC cell lines where an up-regulation of miR-1247-5p was observed in the androgen-independent PC-3 model. According to on-line target prediction tools MYCBP2 (myc-binding protein 2) is a high-scoring potential target of miR-1247-5p. Down-regulation of MYCBP2 at both mRNA and protein levels was demonstrated by overexpression of miR-1247-5p in PC-3 and LNCaP models. Next, MYCBP2 was confirmed as a target of miR-1247-5p by using luciferase reporter assay.

Several high-throughput sequencing studies in human cancers have recently led to the discovery of additional groups of non-coding RNAs. Next to miRNAs, the most abundant non-coding RNAs in prostate cancer cell lines were found to be fragments derived from tRNAs that are termed tRNA-derived RNA fragments (tRFs). The characteristic and abundant expression of the fragments, as well as their precise sequence, indicate that these molecules are not random products of tRNA degradation. However, the precise role of tRFs is still unclear. In this study, the expression of tRFs was analyzed in normal adjacent prostate and different stages of PC by RNA-sequencing. A total of 598 unique tRFs were identified, many of which appear to be deregulated in cancer samples, when compared to controls. Most of the identified tRFs are derived from the 5’ and 3’ end of mature cytosolic tRNAs, but tRFs produced from pre-tRNA trailers and leaders were also found, as well as tRFs from mitochondrial tRNAs. The 5’-derived tRFs comprised the most abundant class of tRFs and represented the major class among upregulated tRFs, while 3’-derived tRFs types were dominant among downregulated tRFs in PC. The expression of three tRFs (tRF-544, tRF-315 and tRF-562) was validated in PC using qRT-PCR. Interestingly, the normalized expression ratio of tRF-315 and tRF-544, derived from tRNALys and tRNAPhe respectively, emerged as a good indicator of progression-free survival and as a candidate prognostic marker.

In conclusion, a novel amplification, which may harbour important oncogenes, was identified in bladder cancer. In addition, several differentially expressed non-coding RNAs were discovered in prostate cancer. They may be important drivers of prostate tumorigenesis and putative biomarkers of aggressive form of the disease.