Protozoan and Metazoan Carbonic Anhydrases - Potential target enzymes for anti-parasitic drug development

Abstract

Hiilihappoanhydraasit (carbonic anhydrase, CA) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat käänteistä veden ja hiilidioksidin muuttumista bikarbonaatiksi ja protoniksi. Nämä entsyymit osallistuvat eliöissä muun muassa happo-emästasapainon säätelyyn, erilaisiin biosynteettisiin prosesseihin sekä hiilidioksidin ja bikarbonaatin kuljetukseen. Reaktion yleisluontoisuudesta johtuen nämä entsyymit esiintyvät laajalti luonnossa. Hiilihappoanhydraasit jaotellaan kuuteen luokkaan: α, β, γ, δ, ζ ja η. ζ-luokkaa löytyy vain meren piilevistä, δ-luokkaa piilevistä ja meren kasviplanktoneista. α-, β- ja γ-CA:t sen sijaan ovat laajalti levinneitä eri lajeihin. Aiemmin on ajateltu, että α-CA:t ovat laajimmin levinnyt CA-luokka. Näitä entsyymeitä on myös tutkittu eniten johtuen ainakin osittain siitä syystä, että kaikki ihmisen CA:t ovat α-luokkaa. Hiljattain löydetty kuudes CA-entsyymiperhe, η-CA:t, näyttää esiintyvän malariaa aiheuttavissa Plasmodium -suvun parasiiteissa.

Tämän väitöskirjatutkimuksen keskeisimpänä tarkoituksena oli selvittää β-CA -entsyymien ilmentymistä ja merkitystä eläimissä (Animalia, Metazoa), tarkemmin määriteltynä selkärangattomissa eläimissä. Pääasiallisena mallieläimenä tutkimuksissa käytettiin banaanikärpästä (Drosophila melanogaster), joka on laajalti käytetty malliorganismi. Banaanikärpäsen β-CA entsyymi tuotettiin ja sen solunsisäinen sijainti selvitettiin hyönteissoluissa. Lisäksi määritettiin entsyymin katalyyttiset ominaisuudet. β-CA -entsyymin merkityksen selvittämiseksi entsyymiä koodaava geeni hiljennettiin, ja selvitettiin tämän vaikutusta banaanikärpäsessä. Väitöskirjatyössä karakterisoitiin myös kaksi banaanikärpäsen α-CA:ta. Banaanikärpäsen β-CA:n lisäksi karakterisoitiin leishmaniaasia aiheuttavan yksisoluisen Leishmania -alkueläimen (alkueläimet, Protozoa) β-CA, ja tutkittiin CA-entsyymin estäjien (inhibiittoreiden) vaikutusta eläviin Leishmania parasiitteihin.

Tutkimuksissa selvisi, että todennäköisesti kaikista selkärangattomista eläimistä löytyy ainakin yksi β-CA. Entsyymin esiintyminen selkäjänteisissä on epäselvää. Tulosten perusteella β-CA entsyymiä koodaava geeni on muuttunut inaktiiviseksi ja hävinnyt evoluution aikana ennen selkärankaisten kehittymistä. Tutkimuksissa selvisi, että banaanikärpäsen β-CA on korkean aktiivisuuden omaava mitokondriaalinen, dimeerinen entsyymi. Sitä koodaavan geenin hiljentyminen ei vaikuta banaanikärpäsen elinkykyyn, mutta aiheuttaa naaraissa täydellisen hedelmättömyyden. Näin ollen entsyymi on oleellinen banaanikärpäsen lisääntymisen kannalta. Ongelma liittynee ainakin osittain ns. border solujen hidastuneeseen vaeltamiseen eli migraatioon. Koska entsyymi on mitokondriaalinen, testattiin myös geenin hiljennyksen vaikutusta mitokondrioiden hengitysketjun toimintaan. Näissä kokeissa ei kuitenkaan havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa verrattuna tavallisiin mitokondrioihin. β-CA:n merkitystä korostaa lisäksi se, että Leishmania -parasiiteille tehdyissä kokeissa tietyillä β-CA inhibiittoreilla saatiin aikaan merkittävä väheneminen parasiittien kasvussa ja eräällä tioli-yhdisteellä lisäksi palautumattomia eliön kuolemaan johtavia solunsisäisiä muutoksia. Kaikkien entsyymien kohdalla tehtiin katalyyttiset määritykset ja testattiin useita erilaisia inhibiittoreita entsyymejä vastaan. Kaikilla entsyymeillä oli korkea katalyyttinen aktiivisuus ja niiden inhibitioprofiili poikkesi selvästi ihmisen entsyymeistä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että β-CA:t näyttävät olevan selkärangattomille eläimille ja alkueläimille tärkeitä entsyymejä. Näitä vastaan kehitetyillä inhibiittoreilla voitaisiin muun muassa rajoittaa erilaisten trooppisten tautien leviämistä ja mahdollisesti myös parantaa erilaisia, lähinnä parasiittien aiheuttamia tauteja. Inhibiittoreiden mahdollisuudet eivät rajoitu pelkästään ihmislääketieteeseen, vaan sovelluskohteita löytyy myös mm. eläinlääketieteen ja kasvinsuojelun aloilta.

Carbonic anhydrases (CAs) are enzymes that catalyze the reversible hydration of carbon dioxide to bicarbonate and proton. These enzymes are involved in many processes in living organisms, including acid-base regulation, a variety of biosynthetic processes and carbon dioxide and bicarbonate transport. Due to the general nature of the reaction, the enzymes are widely found in nature. CAs are divided into six groups: α, β, γ, δ, ζ and η. ζ-class is only found in marine diatoms, δ-class in diatoms and marine phytoplankton. α-, β-, and γ-CAs on the other hand, are widely distributed. Previously, it was thought that the α-CAs are the most widely spread CA group. These enzymes have also been studied the most due at least in part to the fact that all human CAs are α-class. A recently discovered novel CA-group, namely η-CAs, are found in malaria causing Plasmodium parasites.

The aim of this study was primarily to study β-CA enzymes from animals (Animalia, Metazoa), more specifically invertebrate animals. The main model organism in the studies was fruit fly (Drosophila melanogaster), which is a widely used model organism. The Drosophila β-CA was produced as a recombinant protein and its intracellular localization was investigated. In addition, the catalytic properties of the enzyme were determined. The significance of β-CA enzyme to fruit fly was studied by silencing the gene encoding the enzyme, and the effect of this on the fruit fly phenotype was examined. Two Drosophila α-CAs were also characterized during the studies involved in this thesis. In addition to studying Drosophila, a β-CA from Leishmania, a unicellular protozoan (Protozoa) parasite causing leishmaniasis, was characterized and the effect of various inhibitors was tested against living parasites.

The studies showed that at least one β-CA can be probably found from all invertebrate animals. The presence of β-CAs in chordates is unclear. It seems that some organisms have lost the β-CA gene during evolution. In vertebrate animals, including humans, the enzyme is not found. Studies revealed that the fruit fly β-CA is a highly active dimeric mitochondrial enzyme. Silencing of the corresponding gene does not affect the viability of the fruit fly, but causes complete infertility in females. Thus, the enzyme is essential for reproduction of D. melanogaster. It seems that the functional defect in reproduction is at least partly due to slow migration of so called border cells. Since the enzyme is mitochondrial, the effect of gene silencing on mitochondrial respiratory chain was also studied. In these experiments however, statistically significant difference compared to the control mitochondria was not found. The importance of β-CAs is further highlighted by inhibition studies that revealed that some CA inhibitors inhibited the growth of Leishmania parasites in vivo. In addition, one of the thiol CA-inhibitors caused irreversible intracellular changes that led to the death of the parasite. Catalytic assays were performed with all the studied enzymes and a number of different inhibitors were tested against them. All of the enzymes had high catalytic activity and the inhibitor profile was clearly different from human enzymes.

In summary, it can be concluded that invertebrate and protozoan β-CAs seem to be important enzymes for physiology. Inhibitors against these enzymes could be used, for example, to limit the spread of tropical diseases, and possibly to cure various, mainly parasitic, diseases. The possibilities of inhibitors are not limited to human medicine, but the applications can also be found in both veterinary medicine and agriculture.