The application of qPCR for characterization of LQTS-specific cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells

Abstract

Background and aims: Long QT syndrome (LQTS) is an inherent cardiac disorder causing severe arrhythmias due to mutations in cardiac ion channel genes. Four founder mutations causing LQTS have been identified from Finland and they disrupt functions of cardiac potassium ion channels. The aim of this study was to characterize expressions of ion channel genes or their allelic expression variation in three different experiments by using qPCR. In cell line characterization experiment was evaluated applicability of cell lysis -based genotyping method to characterize cardiac cell lines. The aim of the second experiment was to evaluate impacts of allelic expression differences on disease phenotype variation and development. The last experiment was used for examining capacity of single-cell qPCR method to detect specific gene expression within single cardiomyocytes.

Methods: qPCR was used to detect mRNA levels of ion channel genes or structural genes within LQTS-specific cardiomyocytes. The TaqMan® Sample-to-SNP™ Kit was tested in order to characterize KCNQ1 mutated heterozygous cardiac cell lines. Allelic imbalance determination was performed using plasmid-derived standard curve method for each Finnish founder mutations. The Single cell-to-CT™ Kit was used to detect expression of TNNT2 at the single cell level and cell population level.

Results: The used cell lysis -based genotyping method succeeded to characterize cardiac cell lines and any disruption was not detected during analyses. Allelic imbalance determination study revealed that KCNQ1-FinA and KCNQ1-FinB specific cardiomyocytes expressed alleles of KCNQ1 with allelic ratios 3:1 indicating that expression of wild type allele was three-fold as compared to expression of mutant allele within these LQT1-specific cells. The Single cell-to-CT™ Kit did not manage to detect gene expression of TNNT2 within single cell samples and its expression at population level was also reduced.

Conclusions: The detected allelic ratio 3:1 (WT:MUT) within KCNQ1-FinA and KCNQ1-FinB mutated cardiomyocytes could result in milder phenotypic effects due to that higher expression of wild type alleles may suppress effects of mutations. Milder phenotypic effects have been thought to be reason for unique enrichment of founder mutations among Finnish population. Therefore, allelic imbalance occurring in disease-causing genes can be a significant disease phenotype modifier. To validate this hypothesis, larger study population of mutation carriers with high phenotypic variation is needed. If correlation between allelic imbalance and phenotypic variation is detected, the allelic expression variation might be confirmed to be one explaining genetic factor to affect phenotypic variation.

TIIVISTELMÄ: qPCR-menetelmän hyödyntäminen indusoiduista pluripotenteista kantasoluista erilaistettujen LQTS-spesifisten sydänlihassolujen karakterisoinnissa

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Pitkä QT oireyhtymä on vakavia rytmihäiriöitä aiheuttava perinnöllinen sairaus, joka johtuu mutaatioista sydänlihassolun ionikanavageeneissä. Suomessa vallitsee neljä pitkä QT oireyhtymää aiheuttavaa perustajamutaatiota, jotka heikentävät sydänlihassolujen kalium-ionikanavien toimintaa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida LQTS-spesifisten sydänlihassolujen ionikanavageenien ilmentymistä tai niiden alleeli-ilmentymiseroja hyödyntämällä qPCR-menetelmää kolmessa erillisessä työssä. Ensimmäisessä työssä arvioitiin solulyysaukseen perustuvan genotyyppausmenetelmän soveltuvuutta sydänsolulinjojen karakterisointiin. Toisen työn tavoitteena oli arvioida alleeli-ilmentymiserojen vaikutuksia tautifenotyypin vaihteluun ja kehittymiseen. Kolmannen työn tarkoituksena oli tutkia yksisolu-qPCR-menetelmän tehokkuutta havainnoida yksittäisten sydänlihassolujen geeni-ilmentymistä.

Menetelmät: qPCR-menetelmää käytettiin jokaisessa työssä mittaamaan ionikanavageenien tai rakennegeenien mRNA-tasoja LQTS-spesifisistä sydänlihassoluista. Ensimmäisessä työssä käytettiin TaqMan® Sample-to-SNP™ Kit -menetelmää karakterisoimaan heterotsygoottisia sydänsolulinjoja, joissa oli KCNQ1-geenin mutaatio. Alleeli-ilmentymisvaihteluun perustuva tutkimus suoritettiin plasmideista tuotetun standardikuvaajan avulla jokaiselle Suomessa vallitsevalle perustajamutaatiolle. Viimeisessä työssä käytettiin Single cell-to-CT™ Kit -menetelmää, jonka avulla mitattiin TNNT2-geenin ilmentymistä sekä yksittäissolu- että solupopulaatiotasolla.

Tulokset: Ensimmäisen työn tuloksista pääteltiin, että solulyysaukseen perustuva genotyyppausmenetelmä soveltuu sydänsolulinjojen karakterisointiin, eikä analyysiä häiritseviä tekijöitä havaittu. Alleeli-ilmentymiseen perustuva tutkimus paljasti, että KCNQ1-FinA ja KCNQ1-FinB spesifisissä sydänlihassoluissa KCNQ1-geenin alleelit ilmentyivät 3:1-suhteessa, joka tarkoitti sitä, että villityyppialleelien ilmentyminen oli kolminkertainen verrattuna mutanttialleelien ilmentymiseen näissä LQT1-spesifisissä soluissa. Single cell-to-CT™ Kit -menetelmällä ei onnistuttu havainnoimaan TNNT2-geenin ilmentymistä yksittäissolutasolla ja solupopulaatiotasolla sen ilmentyminen oli myös heikkoa.

Johtopäätökset: Havaittu alleeli-ilmentymissuhde 3:1 (WT:MUT) KCNQ1-FinA ja KCNQ1-FinB mutatoituneissa sydänlihassoluissa voisi johtaa mutaatioiden heikentyneisiin fenotyyppivaikutuksiin, koska villityyppialleelin voimakkaampi ilmentyminen saattaa heikentää mutaatioiden vaikutuksia. Aiemmin on arveltu, että perustajamutaatioiden heikompi fenotyyppivaikutus on johtanut niiden yleistymiseen Suomessa. Tällöin taudinaiheuttajageenien alleelien ilmentymiserot saattavat vaikuttaa merkittävästi tautifenotyyppiin. Tämän varmistamiseksi on kuitenkin tutkittava alleeli-ilmentymiserot suuremmasta populaatiosta mutaationkantajia, joilla on havaittu suuri fenotyyppivaihtelu. Jos alleeli-imbalanssin ja fenotyypin välillä havaitaan korrelaatiota, voitaisiin alleeli-imbalanssi varmistaa yhdeksi fenotyyppivaihtelua selittäväksi geneettiseksi tekijäksi.