Characterization of the protease phenotype of cultured human mast cells during their differentiation and maturation
Maaninka, Katariina (2015)
Maaninka, Katariina
2015
Biokemia - Biochemistry
BioMediTech - BioMediTech
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2015-06-08
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201506291918
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201506291918
Tiivistelmä
ABSTRACT
Background and Aims: Mast cells (MCs) are tissue-dwelling effector cells of innate and adaptive immunity that differentiate in peripheral tissues from committed circulating progenitor cells of bone marrow origin. Human MCs are conventionally classified into two major subtypes based on their neutral protease content, namely the MCT, which contain only tryptase and the MCTC, which contain both tryptase and chymase, as well as carboxypeptidase A3 and cathepsin G. Granzyme B has been identified in cultured human MCs and in MCs of human skin. In vitro studies have helped trace factors that regulate human MC development and have provided a powerful method for studying neutral protease expression during MC development. However, inconsistent information from these studies has made it impossible to establish a consistent concept of what causes MCs to develop into MCT and MCTC: are they two committed subtypes deriving from two distinct progenitors with irreversibly predetermined protease phenotype, or are they functional states that MCs assume under the influence of the local microenvironment? Previous findings of human tissue MCs further imply that the phenotypic heterogeneity of human MCs may be greater than initially suggested. However, an understanding of the complexity of the phenotypic heterogeneity of human MCs, and to what extent this heterogeneity is intrinsically variable, has been hindered. This is because virtually all studies describing the relationship of human MC development and protease expression have focused on the expression of tryptase and/or chymase, whereas the expressions of carboxypeptidase A3, cathepsin G, and granzyme B by human MCs have not been fully considered. The aim of the present Master's thesis was to clarify the contradictions on human MC phenotypes and their development by studying how MCs derived from their circulating progenitors express the various neutral proteases during their development.
Methods: MCs were generated from human peripheral blood-derived CD34+ progenitors under the influence of Kit ligand and sequentially added cytokines according to a previously published method. The protease expressions of tryptase, chymase, carboxypeptidase A3, cathepsin G, and granzyme B were investigated on a weekly basis during MC development by flow cytometry and quantitative PCR. Furthermore, immunostainings of the proteases were performed for immunofluorescence microscopy.
Results: All investigated proteases were detected in the developing MCs at week 1 of culture and were increasingly expressed beyond that time. By the end of week 6, a single homogeneous population of cells expressing all the investigated proteases was observed.
Conclusion: The data of the present study suggest that human MCs derive from a common circulating progenitor cell, which has the potential to express the full complement of the investigated proteases. Thus, the heterogeneity of human MC protease phenotypes reflects microenvironmental regulation of protease expression, rather than the existence of distinct progenitor cells with precommitted protease phenotypes.
TIIVISTELMÄ
Viljeltyjen humaanisyöttösolujen proteaasi-ilmiasun karakterisointi syöttösolujen erilaistumisen ja kypsymisen aikana
Tausta ja Tavoitteet: Syöttösolut ovat ihmisen synnynnäisen ja hankitun immuniteetin keskeisiä toimijasoluja, jotka erilaistuvat kudoksissa luuytimestä peräisin olevista, verenkierrossa kiertävistä esiastesoluista. Ihmisen syöttösolut jaetaan perinteisesti kahteen alatyyppiin niiden sisältämien neutraaliproteaasien perusteella. Nämä ovat MCT syöttösolu, joka sisältää ainoastaan tryptaasia ja MCTC syöttösolu, joka sisältää tryptaasia ja kymaasia. Jälkimmäiseen alatyyppiin kuuluvat syöttösolut sisältävät myös karboksipeptidaasi A3:a ja katepsiini G:tä. Lisäksi ihmisen viljellyt ja ihosta eristetyt syöttösolut ilmentävät grantsyymi B:tä. Ihmisen syöttösolujen erilaistaminen viljelyolosuhteissa on mahdollistanut neutraaliproteaasien ilmentymisen tutkimisen syöttösolujen erilaistumisen ja kasvun aikana. Tästä huolimatta on epäselvää, ovatko MCT ja MCTC peräisin kahdesta eri kehityslinjasta vai ovatko ne ennemminkin syöttösolun toiminnallisia tiloja, jotka määräytyvät ympärillä vallitsevien olosuhteiden mukaan. Viime vuosien löydökset viittaavat lisäksi siihen, että ihmisen syöttösolujen proteaasi-ilmiasujen kirjo on luultua monimuotoisempaa. Se, kuinka kirjavaa tämä monimuotoisuus on, ja missä määrin se on synnynnäisesti vaihtelevaa, on kuitenkin epäselvää. Tämä johtuu pääosin siitä, että valtaosa tutkimuksista on keskittynyt vain tryptaasin ja/tai kymaasin ilmentymiseen, kun taas muiden neutraaliproteaasien ilmentymistä ei ole juurikaan tutkittu. Tässä tutkimuksessa seurattiin kaikkien tunnettujen ihmisen syöttösoluproteaasien ilmentymistä viljeltyjen syöttösolujen erilaistumisen ja kasvun aikana. Tavoitteena oli selventää nykyistä käsitystä ihmisen syöttösolujen proteaasi-ilmiasujen monimuotoisuudesta ja niistä tekijöistä, jotka ovat tämän monimuotoisuuden takana.
Menetelmät: Syöttösolut erilaistettiin viljelemällä verenkierrosta eristettyjä CD34+ esiastesoluja tärkeimmän syöttösolujen kasvua edistävän kasvutekijän, Kit ligandin ja jaksoittain lisättyjen sytokiinien, interleukiini (IL)-3:n, IL-9:n ja IL-6:n kanssa. Solujen erilaistumisen ja kasvun aikana tryptaasin, kymaasin, karboksipeptidaasi A3:n, katepsiini G:n ja grantsyymi B:n ilmentymistä tutkittiin viikoittain kvantitatiivisella PCR:lla ja virtaussytometrialla. Lisäksi tehtiin immunovärjäyksiä mikroskopointia varten.
Tulokset: Kaikki tutkitut proteaasit tunnistettiin syöttösolujen kehittymisen aikana sekä mRNA että proteiinitasolla jo ensimmäisen viljelyviikon jälkeen. Proteaasien ilmentymistasot nousivat viljelyn edetessä, ja kuuden viikon jälkeen kaikki syöttösolut ilmensivät tutkittuja proteaaseja. Yhdenkään proteaasin kohdalla ei havaittu erillisiä proteaasipositiivisia tai proteaasinegatiivisia alapopulaatioita, vaan jokaisessa tutkitussa aikapisteessä havaittiin yksi syöttösolupopulaatio, joka ilmensi vaihtelevalla tasolla tutkittua proteaasia.
Yhteenveto: Tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että ihmisen syöttösolut ovat peräsin yhteisestä esiastesolusta, joka pystyy ilmentämään kaikkia tutkittuja neutraaliporteaaseja. Syöttösolujen proteaasi-ilmiasujen heterogeenisyys on seurausta paikallisessa kudosympäristössä olevista tekijöistä, kuten sytokiineista, joilla on kyky säädellä proteaasien ilmentymistasoja.
Background and Aims: Mast cells (MCs) are tissue-dwelling effector cells of innate and adaptive immunity that differentiate in peripheral tissues from committed circulating progenitor cells of bone marrow origin. Human MCs are conventionally classified into two major subtypes based on their neutral protease content, namely the MCT, which contain only tryptase and the MCTC, which contain both tryptase and chymase, as well as carboxypeptidase A3 and cathepsin G. Granzyme B has been identified in cultured human MCs and in MCs of human skin. In vitro studies have helped trace factors that regulate human MC development and have provided a powerful method for studying neutral protease expression during MC development. However, inconsistent information from these studies has made it impossible to establish a consistent concept of what causes MCs to develop into MCT and MCTC: are they two committed subtypes deriving from two distinct progenitors with irreversibly predetermined protease phenotype, or are they functional states that MCs assume under the influence of the local microenvironment? Previous findings of human tissue MCs further imply that the phenotypic heterogeneity of human MCs may be greater than initially suggested. However, an understanding of the complexity of the phenotypic heterogeneity of human MCs, and to what extent this heterogeneity is intrinsically variable, has been hindered. This is because virtually all studies describing the relationship of human MC development and protease expression have focused on the expression of tryptase and/or chymase, whereas the expressions of carboxypeptidase A3, cathepsin G, and granzyme B by human MCs have not been fully considered. The aim of the present Master's thesis was to clarify the contradictions on human MC phenotypes and their development by studying how MCs derived from their circulating progenitors express the various neutral proteases during their development.
Methods: MCs were generated from human peripheral blood-derived CD34+ progenitors under the influence of Kit ligand and sequentially added cytokines according to a previously published method. The protease expressions of tryptase, chymase, carboxypeptidase A3, cathepsin G, and granzyme B were investigated on a weekly basis during MC development by flow cytometry and quantitative PCR. Furthermore, immunostainings of the proteases were performed for immunofluorescence microscopy.
Results: All investigated proteases were detected in the developing MCs at week 1 of culture and were increasingly expressed beyond that time. By the end of week 6, a single homogeneous population of cells expressing all the investigated proteases was observed.
Conclusion: The data of the present study suggest that human MCs derive from a common circulating progenitor cell, which has the potential to express the full complement of the investigated proteases. Thus, the heterogeneity of human MC protease phenotypes reflects microenvironmental regulation of protease expression, rather than the existence of distinct progenitor cells with precommitted protease phenotypes.
TIIVISTELMÄ
Viljeltyjen humaanisyöttösolujen proteaasi-ilmiasun karakterisointi syöttösolujen erilaistumisen ja kypsymisen aikana
Tausta ja Tavoitteet: Syöttösolut ovat ihmisen synnynnäisen ja hankitun immuniteetin keskeisiä toimijasoluja, jotka erilaistuvat kudoksissa luuytimestä peräisin olevista, verenkierrossa kiertävistä esiastesoluista. Ihmisen syöttösolut jaetaan perinteisesti kahteen alatyyppiin niiden sisältämien neutraaliproteaasien perusteella. Nämä ovat MCT syöttösolu, joka sisältää ainoastaan tryptaasia ja MCTC syöttösolu, joka sisältää tryptaasia ja kymaasia. Jälkimmäiseen alatyyppiin kuuluvat syöttösolut sisältävät myös karboksipeptidaasi A3:a ja katepsiini G:tä. Lisäksi ihmisen viljellyt ja ihosta eristetyt syöttösolut ilmentävät grantsyymi B:tä. Ihmisen syöttösolujen erilaistaminen viljelyolosuhteissa on mahdollistanut neutraaliproteaasien ilmentymisen tutkimisen syöttösolujen erilaistumisen ja kasvun aikana. Tästä huolimatta on epäselvää, ovatko MCT ja MCTC peräisin kahdesta eri kehityslinjasta vai ovatko ne ennemminkin syöttösolun toiminnallisia tiloja, jotka määräytyvät ympärillä vallitsevien olosuhteiden mukaan. Viime vuosien löydökset viittaavat lisäksi siihen, että ihmisen syöttösolujen proteaasi-ilmiasujen kirjo on luultua monimuotoisempaa. Se, kuinka kirjavaa tämä monimuotoisuus on, ja missä määrin se on synnynnäisesti vaihtelevaa, on kuitenkin epäselvää. Tämä johtuu pääosin siitä, että valtaosa tutkimuksista on keskittynyt vain tryptaasin ja/tai kymaasin ilmentymiseen, kun taas muiden neutraaliproteaasien ilmentymistä ei ole juurikaan tutkittu. Tässä tutkimuksessa seurattiin kaikkien tunnettujen ihmisen syöttösoluproteaasien ilmentymistä viljeltyjen syöttösolujen erilaistumisen ja kasvun aikana. Tavoitteena oli selventää nykyistä käsitystä ihmisen syöttösolujen proteaasi-ilmiasujen monimuotoisuudesta ja niistä tekijöistä, jotka ovat tämän monimuotoisuuden takana.
Menetelmät: Syöttösolut erilaistettiin viljelemällä verenkierrosta eristettyjä CD34+ esiastesoluja tärkeimmän syöttösolujen kasvua edistävän kasvutekijän, Kit ligandin ja jaksoittain lisättyjen sytokiinien, interleukiini (IL)-3:n, IL-9:n ja IL-6:n kanssa. Solujen erilaistumisen ja kasvun aikana tryptaasin, kymaasin, karboksipeptidaasi A3:n, katepsiini G:n ja grantsyymi B:n ilmentymistä tutkittiin viikoittain kvantitatiivisella PCR:lla ja virtaussytometrialla. Lisäksi tehtiin immunovärjäyksiä mikroskopointia varten.
Tulokset: Kaikki tutkitut proteaasit tunnistettiin syöttösolujen kehittymisen aikana sekä mRNA että proteiinitasolla jo ensimmäisen viljelyviikon jälkeen. Proteaasien ilmentymistasot nousivat viljelyn edetessä, ja kuuden viikon jälkeen kaikki syöttösolut ilmensivät tutkittuja proteaaseja. Yhdenkään proteaasin kohdalla ei havaittu erillisiä proteaasipositiivisia tai proteaasinegatiivisia alapopulaatioita, vaan jokaisessa tutkitussa aikapisteessä havaittiin yksi syöttösolupopulaatio, joka ilmensi vaihtelevalla tasolla tutkittua proteaasia.
Yhteenveto: Tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että ihmisen syöttösolut ovat peräsin yhteisestä esiastesolusta, joka pystyy ilmentämään kaikkia tutkittuja neutraaliporteaaseja. Syöttösolujen proteaasi-ilmiasujen heterogeenisyys on seurausta paikallisessa kudosympäristössä olevista tekijöistä, kuten sytokiineista, joilla on kyky säädellä proteaasien ilmentymistasoja.