Development of a Norovirus Capsid GII-4 and GI-3 Virus-like Particle-based Candidate Vaccine

Abstract

Norovirus (NoV) on rotaviruksen (RV) jälkeen toiseksi yleisin lasten virusperäisen akuutin gastroenteriitin (AGE) aiheuttaja maailmanlaajuisesti. Monissa maissa NoV on kuitenkin noussut tärkeimmäksi AGE:n aiheuttajaksi sen jälkeen, kun RV-rokotteet lisättiin kansallisiin rokotusohjelmiin. Norovirukset luokitellaan geneettisesti kuuteen eri genoryhmään (GI-GVI), joista genoryhmät GI ja GII sisältävät suurimman osan ihmisessä tautia aiheuttavista noroviruksista. Maailmanlaajuisesti yleisin genotyyppi, GII-4, on taudinaiheuttajana 55–85 %:ssa NoV-tautitapauksista. Norovirusta vastaan ei ole rokotetta, mutta tarve lasten, aikuisten erityisryhmien sekä vanhusten rokottamiseen on olemassa.

Tämän väitöskirjatyön ensimmäisessä vaiheessa selvitimme NoV-vasta-aineiden ikäkohtaista esiintyvyyttä 0–14 vuotiailla lapsilla, minkä ansiosta serologinen ympäristö voitiin ottaa huomioon NoV-rokotteen kehityksessä. Kaikissa ikäryhmissä esiintyi NoV-spesifisiä immunoglobuliini (Ig) G ja IgA vasta-aineita. Vastasyntyneillä vauvoilla havaittiin äidiltä peräisin olevia NoV IgG-vasta-aineita, mutta niiden määrä väheni nopeasti syntymän jälkeen. IgG-vasta-aineiden perusteella jopa 47 % 6–23 kuukauden ikäisistä lapsista oli saanut NoV-infektion, ja sekä vasta-aineiden esiintymisen yleisyys että niiden määrä veressä kasvoivat iän myötä. Nämä tulokset osoittavat, että norovirusta esiintyy yleisesti jo pienillä lapsilla ja että toistuvat NoV-infektiot ovat tavallisia. NoV-rokote tulisikin antaa varhaisella iällä, jotta suuri osa lasten NoV-gastroenteriiteistä pystyttäisiin estämään.

Norovirusta ei ole pystytty kasvattamaan laboratoriossa, mikä on estänyt elävän NoV-rokotteen kehittämisen. Elävän rokotteen sijaan NoV-rokotekandidaateiksi on ehdotettu norovirusperäisiä proteiinirakenteita, kuten viruksen kaltaisia partikkeleita (VLP:itä) ja P-partikkeleita. Kumpikaan rakenne ei sisällä NoV-genomia ja rakenteellisesti ne eroavat toisistaan siten, että VLP:t ilmentävät NoV-kapsidin rakenteen kokonaan ja P-partikkelit vain osittain, sisältäen kuitenkin toiminnallisesti tärkeät NoV-partikkelin osat. Toisessa osatyössä vertasimme näiden kahden rakenteen immunogeenisuutta hiirissä. VLP:t aktivoivat ristiin reagoivan vasta-ainevälitteisen ja soluvälitteisen immuunivasteen, kun taas P-partikkelit indusoivat tyyppispesifisiä vasta-aineita. Kokeen tulokset osoittavat, että laajakirjoisen NoV-rokotteen tulisi pohjautua VLP:ihin. Norovirusgenotyyppien laaja kirjo ja NoV-vasta-aineiden yleisyys vaikeuttavat NoV-rokotteen kehittämistä. Olemassa olevasta NoV-immuunivasteesta huolimatta elimistön tulisi kyetä tehokkaasti muodostamaan vasta-aineita uusia, esimerkiksi rokotteen sisältämiä genotyyppejä vastaan. Kolmannessa osatyössä testasimme hiirillä, muodostuvatko vasta-aineet spesifisesti uutta NoV-genotyyppiä vastaan, kun hiiret oli aikaisemmin immunisoitu toisella genotyypillä. Olemassa oleva immuunivaste ei heikentänyt uuden vasta-ainevälitteisen vasteen syntymistä, joten norovirusten kohdalla ei löytynyt viitteitä ”original antigenic sin” -ilmiöstä.

On olemassa vahvoja todisteita siitä, että suoliston solujen pinnalla ilmentyvät kudosveriryhmäantigeenit (histo-blood group antigens, HGBA:t) toimivat noroviruksen tarttumispintana ja/tai tekijänä sisäänmenoprosessissa. NoV-vasta-aineiden tiedetään estävän NoV-VLP:iden sitoutumista HBGA-hiilihydraatteihin in vitro. Osoitimme, että sitoutumista estävillä (eli ”blokkaavilla”) seerumin vasta-aineilla oli yhteys tautisuojaan lapsilla. Tämän havainnon pohjalta pystyimme arvioimaan myös testirokotteiden potentiaalia estää NoV-infektio. Sekä VLP:illä että P-partikkeleilla immunisoitujen hiirien seerumi sisälsi tyyppispesifisiä blokkaavia vasta-aineita. Ainoastaan VLP:t indusoivat ristiin reagoivia blokkaavia vasta-aineita, mutta vaste oli genoryhmäkohtainen. Tämän havainnon perusteella laajakirjoiseen NoV-rokotteeseen tulisi sisällyttää ainakin yksi VLP-genotyyppi molemmista ihmisen päägenoryhmistä (GI ja GII). Viimeisessä osatyössä keskityimme arvioimaan NoV-RV-yhdistelmärokotteen NoV-spesifistä immunogeenisuutta hiirissä. Yhdistelmärokote sisältää noroviruksen GII-4- ja GI-3-peräisiä VLP:itä sekä rotaviruksen VP6-proteiinin. Rokote synnytti vahvan ristiinreagoivan vasta-ainevälitteisen immuunivasteen, ja seerumin vasta-aineet estivät GI- sekä GII-ryhmän eri VLP:iden sitoutumista HBGA-hiilihydraatteihin. Lisäksi NoV-vasta-aineita muodostui hiirten suolistoon. Rokotteen todettiin myös aktivoivan soluvälitteisen puolustuksen T-soluja, mikä saattaa olla tärkeää ristiin reagoivan immuunivasteen kannalta. Immuunivasteet olivat pitkäkestoisia, ja rokotekomponenttien ei havaittu häiritsevän toisiaan vasteiden synnyssä. Näiden tulosten perusteella voidaan todeta, että NoV-RV-yhdistelmärokote on lupaava ehdokas laajakirjoinen NoV-rokotteeksi.

Norovirus (NoVs) is the second most common cause of pediatric viral acute gastroenteritis (AGE) after rotavirus (RV) worldwide. After the introduction of live RV vaccines onto national immunization programs, the importance of NoV as a cause of viral AGE has increased. Genetically diverse NoVs fall into six genogroups (GI–GVI), of which GI and GII contain most of the genotypes causing the human disease. The leading genotype, GII-4, accounts for 55–85% of infections worldwide. Currently there is no vaccine against NoV despite the need for one, especially for young children and for specific target groups among adults and the elderly.

In the first stage of this dissertation, we determined NoV age-related seroprevalence in 0–14-year-old Finnish children to assess the serological background for NoV vaccine development. NoV GII-4-specific immunoglubulin (Ig) G and IgA were detected in all age-groups. Maternally acquired IgG antibodies declined soon after birth. By NoV-specific IgG determination, up to 47% of children aged 6–23 months had already encountered NoV. The seroprevalence as well as the levels of serum NoV-specific antibodies increased with age. These results indicate that NoVs are encountered at a very young age and consecutive NoV infections are probably common. Thus, the NoV vaccine should be administered early to prevent the majority of NoV gastroenteritis cases in children.

There has been no success in culturing human NoVs in vitro, hampering the development of a live virus-based NoV vaccine. Instead, NoV subviral particles, lacking the genome but representing the whole capsid (virus-like particles, VLPs) or parts of the capsid (P-particles), have been considered as antigenically competent alternatives to a live vaccine. We demonstrated in mice that NoV VLPs induced cross-reactive humoral and cellular immune responses, whereas P-particles elicited a type-specific antibody-mediated response, suggesting that for the induction of broad NoV immunity, vaccine development should be focused on VLPs. The high number of NoV genotypes and the resulting pre-existing antibody variability among humans has been a challenge in NoV vaccine design. There is a concern that the pre-existing immunity might have a negative impact on the immune responses generated against novel circulating genotypes or vaccine antigens. We showed in mice that pre-existing immunity against one NoV genotype did not impair induction of humoral response against the de novo genotype; therefore, no proof of “original antigenic sin” among NoVs was observed.

There is strong evidence that histo-blood group antigens (HBGAs), which are expressed on gut mucosal cells, are involved in the binding and/or entry process of NoVs. The blocking assay, a surrogate neutralization assay developed for NoV, measures antibodies that are able to block the binding of NoV VLPs to HBGAs. We observed that children with a high level of blocking antibodies in their sera were less susceptible to NoV infection. As blocking antibodies correlate with protection from NoV infection, the blocking assay can be used to determine a vaccine’s potential to prevent the disease. We tested the capacity of NoV VLP and P-particle subunit vaccines to elicit blocking antibodies against various NoV VLP genotypes from both major genogroups (GI and GII). Both VLPs and P-particles induced serum antibodies in mice that blocked the immunogen-specific strain efficiently. However, only VLP immunization resulted in the development of cross-blocking activity in the sera, but it was in a genogroup-restricted manner. This observation suggests that a broadly effective vaccine should contain at least one VLP from each of the two main genogroups (GI and GII).

The final part of the dissertation focuses on assessing the NoV-specific immunogenicity of a trivalent combination vaccine candidate against NoV and RV in mice. The vaccine contains two NoV VLP genotypes derived from NoV GII-4 and GI-3 and RV VP6. High levels of type-specific and cross-reactive antibodies with broad blocking activity covering genogroups I and II were detected in immunized mice sera. Anti-NoV antibodies were also present in the gut of these animals. Furthermore, the combination vaccine activated the cellular arm of the immune system, which might be important for the induction of heterologous immunity. Both humoral and cell-mediated immune responses were long-lasting, and no interference between the vaccine components was observed. In conclusion, these results suggest that a combination vaccine might be sufficient to induce protective immune responses to a vast majority of the circulating NoVs.