Detection of Enteroviruses in Tissue Samples - Methods and applications in type 1 diabetes

Abstract

Tyypin 1 diabetes (T1D) johtuu haiman insuliinia tuottavien beetasolujen tuhoutumisesta immunologisten mekanismien kautta. Tapahtumaketju, joka johtaa sairastumiseen, on monimutkainen ja vielä osittain epäselvä. Taudin puhkeamista edeltää pitkä oireeton vaihe, jonka merkkinä verenkierrossa esiintyy autovasta-aineita beetasolun rakenteita kohtaan. Geneettinen alttius määrittelee taipumuksen sairastua T1D:een, mutta myös ympäristötekijät ovat tärkeässä osassa taudin synnyssä. Enteroviruksia on pitkään epäilty taudin syntyyn myötävaikuttaviksi tekijöiksi. Useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet T1D:n ja enterovirusten välisen yhteyden, ja virusten löytyminen diabeetikoiden haimasta ja muista kudoksista on vahvistanut epäilyjä enterovirusten osuudesta taudin synnyssä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää immunohistokemiaan ja in situ -hybridisaatioon perustuvia menetelmiä enterovirusten osoittamiseen sekä soveltaa näitä menetelmiä diabeetikoiden ja esidiabeetikoiden kudosnäytteiden analysointiin.

Immunovärjäys yhdeksällä eri enterovirusvasta-aineella tai -vasta-aineyhdistelmällä sekä in situ -hybridisaatio viruksen RNA-genomiin sitoutuvalla koettimella optimoitiin formaliinilla fiksoiduille ja parafiiniin valetuille enteroviruksella infektoituja soluja sisältäville leikkeille. Vastaavasti immunovärjäys seitsemällä eri vasta-aineella tai vasta-aineyhdistelmällä optimoitiin jääleikkeille, ja menetelmien kyky tunnistaa eri enterovirustyyppejä selvitettiin. Useimmat vasta-aineet ja vasta-aineyhdistelmät sekä in situ -hybridisaatio toimivat hyvin ja osoittautuivat hyväksi työkaluksi enterovirusten osoittamiseen tämän tyyppisistä näytteistä.

Enterovirusten ja eräiden immunologisten markkereiden esiintyvyyttä tutkittiin näillä immunohistokemiallisilla ja in situ -hybridisaatiomenetelmillä sekä RT-PCR-menetelmällä diabeetikoiden ja esidiabeetikoiden kudosnäytteistä. Haimanäyte tutkittiin lapselta, jolla oli todettu diabetekseen liittyviä saarekesoluvasta-aineita. Haiman morfologia oli normaali, ja ainoa merkki mahdollisesta immunologisesta reaktiosta oli beta2-mikroglobuliinin runsas tuotanto haiman saarekkeissa. Lapsen haimanäyte oli enteroviruspositiivinen kahdella eri enterovirusvasta-aineella testattuna, mutta in situ -hybridisaatio antoi negatiivisen tuloksen. Myös lapsesta otetut seeruminäytteet olivat enterovirusnegatiivisia RT-PCR-analyysissä.

Virusten esiintyvyyttä tyypin 1 diabeetikoiden ohutsuolessa selvitettiin kahdessa eri tutkimuksessa. Ensimmäisessä tutkimuksessa kahdentoista diabeetikon ja kymmenen verrokin ohutsuolibiopsianäyte värjättiin enteroviruksen VP1-proteiiniin kohdistuvalla vasta-aineella ja viruksen genomin esiintymistä tutkittiin in situ -hybridisaatiolla. Kaiken kaikkiaan yhdeksän diabeetikkoa (75 %) ja yksi verrokki (10 %) olivat positiivisia joko immunohistokemialla tai in situ -hybridisaatiolla (p=0,004). Viruksen läsnäolo vahvistettiin RT-PCR:llä osassa tapauksista. Jälkimmäisessä tutkimuksessa sama tulos toistui suuremmassa aineistossa, johon kuului 39 diabeetikkoa ja 41 verrokkia sekä 40 keliaakikkoa. 74 % diabeetikoista oli enteroviruspositiivisia in situ -hybridisaatiolla verrattuna 29 %:iin verrokeista (p<0,001), ja sama suuntaus oli nähtävissä myös RT-PCR:llä. Positiivisuus in situ -hybridisaatiossa oli myös yhteydessä tulehdusreaktioon suolen limakalvolla.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksessa kehitettiin onnistuneesti uusia immunohistokemiallisia ja in situ -hybridisaatiomenetelmiä enterovirusten osoittamiseen solu- ja kudosnäytteistä. Menetelmiä sovellettiin tyypin 1 diabeetikoiden ohutsuolinäytteiden tutkimiseen, ja niiden avulla osoitettiin ensi kertaa enterovirusten esiintyminen diabeetikoiden ohutsuolen limakalvolla. Lisäksi saatiin merkkejä siitä, että virus voi esiintyä haiman saarekkeissa jo diabeteksen oireettoman esivaiheen aikana. Nämä löydökset tukevat aiempia havaintoja enterovirusten ja tyypin 1 diabeteksen yhteydestä.

Type 1 diabetes (T1D) is a disease in which insulin-producing beta cells in the islets of Langerhans in the pancreas are destroyed by an autoimmune process. The events leading to the development of the disease are complex and still partially unclear. A long preclinical phase defined by the presence of the diabetes-associated autoantibodies in blood precedes the onset of the disease. Genetic predisposition determines the susceptibility to develop T1D, but also environmental factors, of which enterovirus infections are one of the most evident candidates, play an important role. Numerous epidemiological studies have shown the connection between enteroviruses and T1D, and the detection of these viruses directly in the pancreas and other organs of diabetic patients has given new evidence of the role of enteroviruses in disease development. The aim of this study was to develop new immunohistochemical and in situ hybridization methods for enterovirus detection, and to use these methods for the analysis of tissue samples of diabetic and prediabetic subjects to further assess the role of these viruses in the process leading to T1D.

A panel of immunohistochemical and in situ hybridization methods was set-up for the detection of enteroviruses in tissue samples. Immunostaining with nine different antibodies or antibody combinations as well as in situ hybridization were optimized for formalin-fixed paraffin-embedded tissues, and immunostaining with seven different antibodies or antibody combinations for frozen tissues. The optimization and validation of the methods, as well as the evaluation of the ability of the hybridization probe and each antibody to detect different enterovirus serotypes, was carried out in enterovirus-infected cultured cells. Most antibodies as well as in situ hybridization worked well and proved to be a suitable tool for enterovirus detection in tissue samples.

The presence of enteroviruses and certain immunological markers was analyzed using immunohistochemical and in situ hybridization methods and RT-PCR from a prediabetic child who had accidentally died and who had been repeatedly positive for islet cell antibodies. The morphology of the pancreas was normal, and the only marker of a possible beta cell-damaging process was the strong production of beta2-microglobulin in the islets. The child was also positive for enterovirus in the pancreatic islets in immunohistochemical staining with two different enterovirus-specific antibodies; however, in situ hybridization assay was negative. All follow-up serum samples taken preceding his death turned out to be enterovirus-negative in RT-PCR.

The presence of enteroviruses in the small intestine of T1D patients was analyzed in two separate studies. In the first study, small intestinal biopsies of twelve T1D patients and ten controls were analyzed by immunohistochemistry with enterovirus VP1 protein-specific antibody and in situ hybridization. Nine of the patients (75 %) and one of the control subjects (10 %) were enterovirus positive in either in situ hybridization or immunohistochemistry (p=0,004). The presence of the virus was also confirmed by RT-PCR in some of the cases. In the second study, the same result was confirmed in a larger cohort which included intestinal biopsies from 39 T1D patients and 41 controls, as well as from 40 celiac disease patients. 74 % of the T1D patients were enterovirus-positive in in situ hybridization compared to 29 % of the control subjects (p<0,001), and the same trend was also seen in RT-PCR. The presence of enterovirus in in situ hybridization was also associated with the detection of inflammation markers in the duodenal mucosa.

In conclusion, methods for enterovirus detection in tissue samples were set-up and optimized. The panel included several antibodies or antibody combinations and in situ hybridization assay which can be used for the detection of enteroviruses in both formalin-fixed paraffin-embedded and frozen tissue samples. These methods were applied in the analysis of pancreatic tissue of a prediabetic child, as well as in the examination of small intestine biopsy samples of T1D patients. The results suggest that enteroviruses can be detected in the pancreas and duodenum of T1D patients. These findings further strengthen the hypothesis of a pathogenic role of enteroviruses in the development of type 1 diabetes.