Complementation of Cytochrome c Oxidase Deficiency by Transgenic Expression of the Alternative Oxidase in Drosophila

Abstract

Sytokromi c oxidaasin vajaatoiminnan komplementaatio siirtogeenisen AOX-entsyymin avulla

Mitokondriot ovat soluorganelleja, joilla on useita elintärkeitä tehtäviä. Näistä tärkeimpänä voidaan pitää solujen tarvitseman energian (ATP) tuottoa oksidatiivisen fosforylaation eli soluhengityksen avulla. Mitokondriosairauksiksi kutsutaan suurta joukkoa erilaisia perinnöllisiä sairauksia, joissa mitokondrioiden toiminta on häiriintynyt. Solujen energia-aineenvaihdunnan häiriintyminen johtaa oireisiin erityisesti runsaasti ATP:a tarvitsevissa kudoksissa, kuten lihaksissa, sydämessä, aivoissa, ja maksassa. Vakavimmillaan oireet voivat puhjeta heti syntymän jälkeen, johtaen varhaiseen kuolemaan, kun taas toisissa sairauksissa oireet voivat ilmetä vasta aikuisiällä. Mitokondriosairauksien kliininen kuva on hyvin monimuotoinen, eikä parantavaa hoitoa ole toistaiseksi olemassa. Harvinaisten perinnöllisten sairauksien lisäksi mitokondrioiden toimintahäiriöitä pidetään nykyisin monien ikääntymiseen liittyvien rappeumasairauksien sekä muiden yleisten sairauksien patogeneesin yhtenä osatekijänä.

Sytokromi c oksidaasi (COX) on mitokondriaalisen hengitysketjun neljäs kompleksi, jonka tehtävänä on siirtää ravintoaineiden hapetuksessa muodostuneet, hengitysketjuun kuljetetut elektronit hapelle. Samalla COX-entsyymin toiminta edistää ATP:n tuottoon tarvittavan elektrokemiallisen gradientin muodostumista. COX on useasta alayksiköstä koostuva proteiinikompleksi. Näitä alayksikköjä koodaavat geenit sijaitsevat osin mitokondrion omassa perimäaineksessa (mtDNA) ja osin tuman DNA:ssa. COX:n vajaatoiminta on yksi yleisimmistä ja oireiltaan vakavimmista mitokondriotautien muodoista. Se voi aiheutua geenivirheestä missä tahansa kompleksin alayksikköä tai sen biosynteesiin tarvittavaa tekijää koodaavassa geenissä. Tässä työssä käytettiin malliorganismina banaanikärpästä (<i>Drosophila melanogaster</i>), jossa COX:n vajaatoiminta saatiin aikaan mm. hiljentämällä COX:n toimintaan vaikuttavia geenejä RNA-inteferenssin avulla.

Useilla alemmilla eukaryooteilla, kuten myös joillain eläinlajeilla, on vaihtoehtoinen, ATP:a tuottamaton mitokondriaalinen hengitysketju. Nisäkkäiden ja muiden kehittyneempien eliöiden perimästä vaihtoehtoisen hengitysketjun entsyymejä koodaavat geenit ovat kuitenkin evoluution myötä hävinneet. Näihin vaihtoehtoisiin entsyymeihin kuuluva AOX (alternative oxidase) siirtää elektroneja hapelle ohittaen kompleksit III ja IV niiden ollessa viallisia tai inhiboituja. Muodostamalla vaihtoehtoisen reitin elektronien siirrolle AOX:n toiminta mahdollistaa hengitysketjun sekä siihen linkittyvien aineenvaihduntareittien toiminnan ja korjaa ketjun hapetus-pelkistys tasapainoa ehkäisten siten haitallisten vapaiden happiradikaalien tuottoa.

Väitöskirjatyöni tarkoituksena oli tutkia siirtogeenisen AOX:n kykyä toimia molekyylitason ohitusreittinä COX:n toimintahäiriöissä ja korjata entsyymin vajaatoiminnasta johtuvia oireita. Työssä tuotettiin siirtogeeninen kärpäsmalli, joka ilmentää<i>Ciona intestinalis </i>-vaippaeläimeltä peräisin olevaa AOX-geeniä. AOX:n ekspression ei todettu vaikuttavan haitallisesti kärpäsen kehitykseen tai fysiologiaan. Sen sijaan siirtogeeniset kärpäset olivat resistenttejä hengitysketjun salpaajille, kuten syanidille. Kärpäsen COX-entsyymiin tarvittavien geenien hiljentämisen vaikutuksia tutkittiin kärpäsen eri kehitysvaiheissa sekä koko kärpäsessä että sen yksittäisissä kudoksissa, lihaksessa ja hermostossa. Ekspressoimalla AOX:a kärpäsissä, joiden COX-aktiivisuus on alentunut, voitiin osoittaa AOX:n kyky kompensoida laajasti COX:n vajaatoiminnan aiheuttamia oireita. AOX:n ekspressio mahdollisti muutoin letaalista COX:n vajaatoiminnasta kärsivien kärpästen kehittymisen ja paransi niiden patologista ilmiasua merkittävästi antaen viitteitä AOX:n potentiaalista tulevaisuuden terapeuttisena strategiana COX:n toimintahäiriöön liittyvien sairauksien hoidossa.

Dysfunction of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) underlies a large number of human diseases with highly variable phenotypic presentations. Although progress has been made in elucidating the molecular pathogenesis of mitochondrial disorders, there are no effective ways to cure these often devastating diseases. Cytochrome c oxidase (COX, complex IV) deficiency is among the most common and most severe forms of mitochondrial OXPHOS dysfunction. It can be caused by defects in either mtDNA-encoded or nuclear-encoded subunits of the enzyme, or the large number of nuclear-encoded factors required for its biosynthesis and assembly.

The alternative oxidase (AOX), present in many lower eukaryotes, provides a bypass of complexes III and IV of the mitochondrial respiratory chain under conditions of respiratory stress or overload. AOX has also been found in several animal phyla, but is absent from vertebrates and arthropods. Activated upon over-reduction of the quinone pool, AOX transfers electrons directly from ubiquinol to molecular oxygen without concomitant proton pumping. The work presented in this thesis was aimed at investigating the potential of AOX as a molecular bypass of defective COX, by transgenic expression of the AOX gene from the Ascidican Ciona intestinalis in <i>Drosophila melanogaster</i>.

The use of Drosophila as a model organism provides many practical advantages, including the large variety of tools readily available for manipulation of its genome. In this study, COX deficiency was produced by GAL4-dependent RNA interference (RNAi) against various structural subunits of COX and the assembly factor Surf1, as well as via a point mutation (levy1) affecting one of the structural subunits. Transgenic flies expressing AOX constitutively were created and characterised, and the effects of both conditional and constitutive expression of AOX on the COX deficient phenotypes were studied. In addition, various different GAL4 drivers, including ubiquitous, tissue-specific and inducible drivers, were utilized to drive the expression of AOX and the RNAi silencing in different tissues and stages of fly development. Finally, the ability of AOX to compensate generalized OXPHOS deficiency, resulting from defective mitochondrial translation, was assessed by studying the effects of AOX expression on the phenotype of the fly mutant, technical knockout (tko25t).

AOX from <i>Ciona intestinalis</i> was well tolerated and enzymatically functional in Drosophila, conferring significant cyanide resistance to the flies. Expression of AOX in flies also complemented partial deficiency of COX, providing complete or substantial rescue of phenotypes produced by knockdown of nuclear-encoded structural subunits of COX, whether required for early (Cox4, Cox5a), intermediate (Cox5b, Cox6c) or late steps (Cox6b, Cox7a) of COX assembly, or the multimerization of the complex (Cox6a). It also complemented the knockdown of an essential assembly factor, Surf1, representing a Drosophila model of COX-deficient Leigh syndrome. Furthermore, AOX expression was able to overcome the developmental lethality of muscle-specific knockdown of COX, and provided partial rescue of the adult-onset neurodegenerative phenotypes resulting from neuronal knockdown of COX, or the levy1 (Cox6a) mutation. AOX was, however, unable to rescue the major phenotypic features of tko25t mutant flies with defective mitochondrial protein synthesis and a consequent functional deficiency of all four OXPHOS complexes containing mitochondrial translation products. While possible clinical applications remain a distant goal, these results suggest AOX to be a promising therapeutic strategy for the large and heterogeneous group of pathologies associated with isolated COX deficiency. In case of generalized impairment of OXPHOS, AOX expression may in turn be of limited therapeutic value.