Probing the Mammalian Mitochondrial Nucleoid

Abstract

Mitokondrioiden tärkein tehtävä on energian tuottaminen. Mitokondriot ovat solujen hengityskeskuksia, joissa 90 % tarvitsemastamme energiasta tuotetaan oksidatiivisen fosforylaation kautta elektroninsiirtoketjua apuna käyttäen. Kun mitokondriot eivät toimi kunnolla, tuloksena voi olla energiakriisi, erityisesti lihaksissa, aivoissa ja sydämessä. Lisäksi mitokondrioilla on muita tehtäviä solun perustoiminnoissa, kuten ionitasapainon säilyttämisessä, aminohappojen synteesissä ja solun apoptoosissa eli ohjelmoidussa solukuolemassa. Mitokondrioilla on oma DNA (mtDNA), joka koodaa 13:a hengitysketjussa olevaa polypeptidiä. Loput hengitysketjun polypeptideistä koodataan tuman DNA:sta. Lisäksi mtDNA sisältää mitokondrion proteiinisynteesissä tarvittavat siirtäjä- ja ribosomaaliset RNA:t. Tuman DNA:sta koodataan myös kaikki mtDNA:n ylläpidossa tarvittavat proteiinit, jotka tuotetaan sytoplasmassa ja kuljetetaan mitokondrioihin. Mutaatiot mtDNA:n ylläpitoon osallistuvissa proteiineissa voivat vaikuttaa mitokondrion toimivuuteen. Esimerkiksi mitokondrion helikaasiproteiinissa, Twinklessä, esiintyvien mutaatioiden on osoitettu johtavan mtDNA-deleetioihin tai kopioluvun vähenemään, jotka johtavat neuromuskulaarisiin sairauksiin, kuten adPEO (etenevä silmälihas heikkous).

Väitöskirjatyössäni olen selvittänyt Twinklen rakennetta. Havaintoni vahvistivat Twinklen esiintyvän heksameerisina ja heptameerisina rakenteina. Twinkle kuuluu SF4 heksameeriseen DnaB helikaasi -perheeseen ja se on lähisukulainen bakteriofagi T7 g4 -helikaasille. T7 gp4 -helikaasin linkkeri–alue osallistuu proteiinin oligomerisaatioon. Tutkimuksessani olen osoittanut, että toisin kuin T7 gp4 proteiinilla, linkkeri-alueen lisäksi Twinklen aminoterminaalinen osa toimii oligomerisaatiossa. Monet Twinklen mutaatiot esiintyvät tässä osassa proteiinia ja tiedot Twinklen rakenteesta auttavat meitä ymmärtämään, miten tietyt mutaatiot johtavat Twinklen toimintahäiriöihin.

MtDNA on pakattu nukleoideiksi kutsuttuihin mtDNA-proteiinikomplekseihin, joiden rakentumista ei ole täysin ymmärretty. Vaikka nukleoidien koostumusta ei tunneta hyvin, tiedetään, että mtDNA:n monistamiseen käytetty koneisto on osa nukleoidien rakennetta. Tähän koneistoon kuuluu esimerkiksi Twinkle-helikaasi. Vaikka nukleoidien kiinnittymisestä mitokondrion sisäkalvolle on tiedetty jo 1960-luvulta lähtien, kiinnittymisen mekanismi on ollut epäselvä. Väitöskirjatutkimukseni on osoittanut, että nukleoidit kiinnittyvät mitokondrion sisäkalvolle Twinkle-helikaasin välityksellä. Tämä kiinnittyminen on dynaaminen siten, että vain aktiivisesti replikoituvat nukleoidit kiinnittyvät Twinkle-helikaasiin. Tutkimukseni on myös osoittanut että kaikki nukleoidit eivät ole pysyvästi kiinnittyneet mitokondrion sisäkalvolle, toisin kun on edellisten tutkimusten perusteella ajateltu.

Monet tutkijat ovat olleet kiinnostuneita selvittämään nukleoidien koostumusta ja rakennetta, mutta tähänastinen nukleoiditutkimus on keskittynyt suurimmaksi osaksi ei-kvantitatiiviseen tutkimukseen. Olen kehittänyt uudenlaisen nukleoidiproteiinien eristysmenetelmän, jossa käytetään kokonaisia soluja, jolloin mitokondrioiden eristämiseen ei ole tarvetta. Yhdistettynä immunoaffiniteettipurifikaation ja kvantitatiivisen massaspektometrian kanssa (käyttäen label free quantification – tekniikkaa), menetelmä tarjoaa yksinkertaisen ja toistettavan tavan nukleoidiproteiinien tunnistamiseen. Tällä menetelmällä olemme tunnistaneet monia jo tiedettyjä nukleoidiproteiineja, sekä listanneet joukon proteiineja, jotka voivat osoittautua tärkeiksi mtDNA:n ylläpidossa.

Väitöskirjatutkimukseni on tuottanut tärkeää tietoa Twinklen rakenteesta ja organisoitumisesta mitokondrion sisäkalvolle. Tutkimukseni auttaa ymmärtämään mtDNA:n ylläpitoa yleisesti ja siten myös paremmin mitokondrion sairauksia. Lisäksi olemme systemaattisesti tutkineet nukleoidien rakennetta massaspektrometrian avulla. Löytämämme proteiinit ovat myös mielenkiintoinen jatkotutkimuskohde ja tärkeä tiedon lähde muille mitokondriotutkijoille.

Mitochondria are involved in many cellular functions, which the most important is the supply of energy in form of ATP, which is produced by the oxidative phosphorylation system (OXPHOS). In addition, mitochondria are involved in other important cellular functions including providing cellular constituents, calcium storage and apoptosis. Mitochondria have their own DNA (mtDNA) that codes for parts of the OXPHOS and the rest is coded by the nuclear genome. Among the nuclearly encoded proteins are those involved in mtDNA maintenance, which have during evolution moved to the nucleus. The unique feature of having its own DNA means that both nuclear and mtDNA can affect the mitochondrial functions and mutations in either genome can lead to mitochondrial dysfunction. For example, mutations in mitochondrial helicase Twinkle have been implicated in adPEO (autosomal dominant progressive external ophthalmoplegia) and shown to cause mtDNA deletions. This in turn results in a loss of OXPHOS genes and leads to decrease in energy production. In vitro studies have shown that depending on the mutation either the helicase activity, ssDNA binding property or oligomerisation of Twinkle can be affected. In addition, the most severe mutant forms of Twinkle can cause replication stalling.

In this present study, we have investigated the structure of Twinkle and the results show the existence of Twinkle as hexamers and heptamers. Twinkle is a close relative of bacteriophage T7 gp4 primase/helicase protein and belongs to the SF4 family of hexameric replicative DnaB-like helicases. Oligomeric transitions between hexamers and heptamers have also been shown for T7 gp4 protein. Further, we show that the stabilisation of Twinkle oligomeric structure is dependent on the N-terminal portion of the protein and unlike the T7 gp4 protein, the linker region is not solely responsible for the oligomerisation. The functional importance is corroborated by the existence of several Twinkle disease mutants in this domain. Since the discovery that also mtDNA is found in discrete mtDNA:protein structures referred to as nucleoids, research on determining the composition of nucleoids has caught the interest of mitochondrial researchers. Research this far has used nucleoid complexes isolated from mitochondria and has concentrated mostly on non-quantitative methods and on examination of one protein found in the mass-spectrometry-screen. Here we show that whole cell formaldehyde crosslinking combined with affinity purification and tandem mass-spectrometry provides a simple and reproducible method to identify potential nucleoid associated proteins by mass-spectrometry. We also investigated the composition of Twinkle associated nucleoids in cells lacking mtDNA and were able to identify proteins that are reduced or absent when mtDNA is not present. The fact that nucleoids are membrane bound is a long-standing observation, but the mechanism is still unclear. Here we show that Twinkle is firmly membrane associated even in the absence of mtDNA unlike single-stranded DNA-binding protein (mtSSB) and mitochondrial transcription factor A (TFAM). Further investigation on the association of replication factors with nucleoids show that endogenous Twinkle and mtSSB co-localize only with a subset of nucleoids. Using nucleotide analogs to identify replicating nucleoids we were able to show that nucleoids transiently associate with Twinkle when there is a need for replication while mtSSB is recruited to nucleoids in Twinkle dependent manner.

In conclusion, the work here gives important information on the structure of mitochondrial helicase Twinkle, which will help us to understand Twinkle caused mitochondrial disorders. Furthermore, our results show that Twinkle has an important role during mtDNA replication so that Twinkle recruits or is assembled with mtDNA at the inner membrane to form a replication platform and amount to the first clear demonstration that nucleoids are dynamic in both composition and concurrent activity. The nucleoid isolation work here offers a fast and quantitative method for nucleoid associated protein isolation, which can be applied to screen for example, Twinkle mutant expressing cell lines in search for factors important during diseases. Our data provides a very valuable resource for both basic mitochondrial researchers as well as clinical geneticists working to identify novel disease genes on the basis of exome sequence data.