Differentiation of human pluripotent stem cells towards functional retinal pigment epithelium for future therapeutic applications

Abstract

Verkkokalvo on silmän valoa aistiva osa, joka sijaitsee silmän takaosassa. Verkkokalvo koostuu kahdesta erillisestä kerroksesta: monimuotoisesta hermo- ja hermotukisolujen verkostosta (neural retina) sekä yksikerroksisesta verkkokalvon pigmenttiepiteelistä (retinal pigment epithelium, RPE). RPE-solut muodostavat tiiviin epiteelin, joka ylläpitää verkkokalvon toimintoja monin eri tavoin. Toimimaton RPE vaikuttaakin koko verkkokalvon terveyteen ja johtaa näkökyvyn heikkenemiseen tai jopa menetykseen. RPE:n toiminatahäiriöstä johtuvat verkkokalvon rappeumasairaudet koskettavat joka kolmatta yli 75-vuotiasta länsimaalaista. Näihin sairauksiin ei toistaiseksi ole parantavaa hoitokeinoa. Solusiirron, jossa vaurioituneet solut korvattaisiin toimivilla soluilla, uskotaan kuitenkin olevan tulevaisuuden hoitokeino verkkokalvon sairauksiin. Lisäksi autenttista RPE:tä vastaavan solumallin avulla voitaisiin hankkia ainutlaatuista tietoa ihmisen RPE:n toiminnallisuudesta, kehityksestä, sairauksista sekä lääkeaineiden kulkeutumisesta verkkokalvolle.

Erittäin monikykyiset kantasolut (human pluripotent stem cells) voivat jakautua rajattomasti erilaistumattomina tai erilaistua miksi tahansa ihmisen solutyypeiksi laboratoriossa. Näistä kantasoluista erilaistetuilla RPE-soluilla on todettu olevan useita autenttisen RPE:n ominaisuuksia, minkä vuoksi erittäin monikykyisiä kantasoluja pidetään yhtenä lupaavimmista RPE-solujen lähteistä. Ihmisen erittäin monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen RPE-solujen turvallisuutta ja soveltuvuutta verkkokalvon sairauksien hoitoon tutkitaankin jo ensimmäisissä kliinisissä kokeissa. Näiden solujen hyödyntäminen edellä mainituissa sovelluksissa edellyttää tehokkaampien ja turvallisempien erilaistamis- ja kasvatusmenetelmien kehittämistä, laajaa solujen karakterisointia sekä standardisoidun menetelmän kehittämistä solusiirron mahdollistamiseksi verkkokalvon takaosaan. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli kehittää menetelmiä, joiden avulla voidaan edesauttaa kantasoluista erilaistettujen RPE-solujen hyödyntämistä tulevaisuuden sovelluksissa. Ensiksi osoitettiin, että RPE-soluja saadaan erilaistettua spontaanisti useista ihmisen fibroblastien avulla ylläpidetyistä erittäin monikykyisistä kantasolulinjoista. Spontaani alttius erilaistua RPE-soluiksi vaihteli solulinjojen välillä. Lopullinen erilaistamistehokkuus jäi alhaiseksi, vaikka silmän luonnolliseen kehitykseen nähden RPE:n erilaistuminen tapahtui nopeasti laboratorio-olosuhteissa. Erilaistamisprosessin ymmärtäminen auttaa jatkokehittämään menetelmiä RPE-solujen tuottamiseksi. Toiseksi tässä tutkimuksessa osoitettiin, että RPE-solujen erilaistaminen erittäin monikykyisistä kantasoluista voidaan tehdä ihmiselle vieraita aineita sisältämättömässä kasvatusliuoksessa, mikä on tärkeää soluhoidon turvallisuuden lisäämiseksi sekä tasalaatuisemman solutuotannon takaamiseksi.

Solusiirtojen onnistumisen sekä toimivan epiteelimallin kannalta on ensiarvoisen tärkeää, että erilaistetut solut vastaavat ominaisuuksiltaan ja toiminnallisuudeltaan autenttista RPE:tä. Laaja karakterisointi osoitti näillä erilaistetuilla soluilla olevan useita ihmisen autenttiselle RPE:lle tyypillisiä ominaisuuksia, kuten morfologia, pigmentaatio, geenien ja proteiinien ilmentyminen sekä polarisaatio. Tämän lisäksi RPE:n toiminnallisuudelle tärkeistä ominaisuuksista erilaistetuilla soluilla todennettiin olevan autenttisen RPE:n kaltaiset elektrofysiologiset ominaisuudet ja läpäisevyys, kyky fagosytoida näköaistinsolujen uloimpia segmenttejä sekä kyky erittää RPE:lle tyypillistä kasvutekijää. Viimeisimpänä erilaistettujen solujen todennettiin ilmentävän aktiivisen kulkeutumisen kannalta merkittäviä efflux-proteiineja. Lisääntynyt tieto efflux-proteiineista RPE:ssä auttaa kehittämään uusia lääkeaineita verkkokalvon sairauksiin. Epiteelin tiiviys on välttämätöntä RPE:n toiminnalle, minkä vuoksi solujen siirtäminen tiiviinä rakenteena on luonnollisin tapa siirtää RPE-soluja. Viimeiseksi tässä työssä arvioitiin erilaistettujen solujen kasvua polyimide (PI) -kalvolla. PI:n mekaaniset ominaisuudet ovat sopivat hPSC-RPE-solujen tukirakenteeksi. Muut sovellukset ovat osoittaneet, että PI on hyvin siedetty siirrettynä ihmisen silmään, mikä lisää toiveita sen toimivuudesta kliinisissä solusiirroissa. PI ei tukenut RPE:n kaltaisten solujen kasvua sellaisenaan, minkä vuoksi vertailtiin eri biopolymeerien toimivuutta solujen kiinnittymisen parantamisessa. Useamman biopolymeerin todettiin parantavan solujen kiinnittymistä ja kypsymistä PI-kalvolla, minkä ansioista PI-kalvoa voidaan pitää potentiaalisena tukialustana siirrettäessä RPE-soluja viljelmistä jatkosovelluksiin, mukaan lukien soluterapia. Tämä tutkimus on yhtäältä lisännyt ymmärrystä ihmisen erittäin monikykyisten kantasolujen erilaistamisesta RPE-soluiksi sekä näiden solujen ominaisuuksista, ja toisaalta edesauttanut RPE-mallin syntymistä sekä turvallisen ja toimivan hoitokeinon kehitystä verkkokalvon rappeumasairauksiin.

The light-detecting retina is located at the back of the eye and consists of two layers: a complex network of sensory cells (neural retina) and a monolayer of retinal pigment epithelial (RPE) cells. RPE cells form a tight epithelium that maintains retinal functions in several ways. Thus, RPE dysfunction affects the health of the entire retina, causing the impairment or even loss of vision. Retinal diseases caused by dysfunctional RPE affect every third person aged 75 and older, and current treatments for these diseases are unsatisfactory. However, a cell therapy in which dysfunctional cells are replaced with healthy ones is believed to be a promising future treatment for retinal degenerations. In addition, in vitro models resembling authentic RPE would increase our understanding of RPE physiology, diseases, and pharmacokinetics.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are able to divide without limit and can be differentiated in vitro into any cell type of human body. Studies have shown that hPSC derived RPE (hPSC-RPE) has several characteristics of authentic RPE, thus hPSCs have been promoted as one of the most potent sources of RPE cells. Consequently, the first clinical trials related to the safety and suitability of hPSC-RPE for the treatment of retinal diseases have been launched. However, the invocation of hPSC-RPE cells in the previously mentioned applications still presumes the wide characterization of the cells, the development of more efficient and safer methods for the production of functional hPSC-RPE, and standardized protocols for hPSC RPE transplantations into the subretinal space of the eye. This dissertation aimed to evaluate and improve protocols for hPSC-RPE differentiation, characterization, and transplantation for future approaches. Firstly, it was shown that putative RPE cells arise spontaneously from numerous hPSC lines that are maintained using human fibroblast feeder cells. The tendency to spontaneous differentiation varied between hPSC lines. Although the resulting differentiation efficacy remained moderate, RPE cells arose relatively quickly in vitro when compared with the natural development of human RPE. Increased understanding of RPE differentiation will help to improve methods for hPSC RPE production. Secondly, it was demonstrated that a xeno-free culture medium is proper for hPSC-RPE differentiation. The avoidance of animal derived components in the production protocol is important because they may transfer pathogens to the host.

For the development of hPSC-RPE applications, it is remarkably important to identify the properties and quality of hPSC-RPE cells. A broad characterization panel showed that the cells differentiated in this dissertation work resembled native human RPE cells based on morphology, pigmentation, gene and protein expression, and cell polarization. Functionality analyses demonstrated that hPSC-RPE cells had the ability to phagocytize photoreceptor outer segments and to secrete RPE related growth factor. In addition, they had similar electrophysiological and permeability properties as their native counterparts. Furthermore, it was shown that hPSC-RPE cells expressed efflux proteins, which are significant for the active transportation of molecules, e.g. drugs, through the blood–retina barrier. An increased understanding of the efflux proteins in the RPE is significant for the development of drugs for eye diseases. Epithelial integrity is essential for a functional RPE, thus transplantation of the RPE as a tight epithelium is the most natural way to transplant hPSC-RPE cells into a diseased eye. Lastly, polyimide (PI) biomembrane was studied as a scaffold for hPSC RPE. The mechanical properties of PI satisfy the requirements for an RPE scaffold. Additionally, the biocompatibility of PI has been proven in other solutions, which increases the promise of its suitability for retinal transplantations. PI as such was not suitable for supporting hPSC-RPE propagation; thus, different biopolymers for cell adhesion enhancement were evaluated. Many of the studied biopolymers improved hPSC-RPE cell adhesion and maturation on PI. Consequently, PI can be considered as a potential scaffold for hPSC-RPE in future applications, including cell therapy. To conclude, this dissertation has increased understanding of hPSC-RPE differentiation and characteristics; this knowledge can be utilized in future applications with these cells. In addition, these results have contributed to the generation of a functional and transplantable hPSC-RPE free of animal derived materials, which improves the safety and quality of future cell therapy.