Distribution and Function of Carbonic Anhydrase Related Proteins (CARPs) VIII, X and XI

Abstract

Hiilihappoanhydraasien kaltaiset proteiinit – hermoston kehityksen ja toiminnan säätelijöitä?

Tässä väitöskirjassa on tutkittu hiilihappoanhydraasien kaltaisia proteiineja (CARP, carbonic anhydrase related proteins), jotka ovat kehittyneet tai tavallaan surkastuneet toimivista entsyymeistä, hiilihappoanhydraaseista. Siis näiltä CARP-proteiineilta puuttuu kyky edistää kemiallista reaktiota, jota muut hiilihappoanhydraasit pystyvät katalysoimaan, koska CARP:ien aktiivinen keskus ei pysty sitomaan kriittistä sinkkiatomia. Kuitenkin nämä proteiinit (CARP VIII, X ja XI) ja niiden geenit (CA8, CA10, CA11) ovat säilyneet evoluutiossa erittäin samankaltaisina kaikissa selkärankaisissa, ja ne ilmentyvät pääasiassa aivoissa, joten niillä mitä ilmeisimmin on jokin tärkeä tehtävä. Tämä väitöskirjatyö on paneutunut näiden arvoituksellisten proteiinien tehtävien selvittämiseen.

CARP VIII:n kohdalla tiedetään, että se esiintyy tasapainosta ja motoriikasta vastuussa olevissa pikkuaivoissa, ja sen geenivirheet johtavat motoriikan häiriöihin hiirissä ja ihmisissä, ja lisäksi lievään vajaamielisyyteen ihmisissä. Tässä työssä tutkittiin CA8-geenin ilmentymistä seeprakalan poikasissa 5 päivän ikään asti. Havaitsimme, että CA8-taso on erittäin korkealla jo hedelmöityneessä munasolussa. Lisäksi kehitimme seeprakalamallin, jossa CA8:n ilmentyminen estettiin seeprakalan munassa. Yllättävä havainto oli, että estettäessä geenin toiminta kokonaan, kalan alkiot kuolivat, siis ilmeisesti CA8 on kriittinen geeni alkionkehityksessä. Osittainen esto johti kalojen kehittymiseen epämuodostuneina, ja erittäin pienikin esto, jossa kalanpoikaset kehittyivät normaalin muotoisina, johti kalanpoikasten uintikyvyn heikkenemiseen. Tämä uusi eläinmalli siis simuloi ihmisen CA8:n geenivirheiden motoriikkahäiriöitä, ja voi auttaa selvittämään näiden geenivirheiden tautimekanismeja ja mahdollisia hoitokeinoja.

Vastaavan kaltaiset seeprakalamallit kehitettiin myös CA10:n kaltaisille geeneille (kaloissa ca10a ja ca10b). Myös nämä geenit ilmentyvät pääasiassa aivoissa, ja niiden toiminnan estäminen haittasi kalan normaalia alkionkehitystä, erityisesti aivojen. Nämä geenit eivät kuitenkaan olleet aktiivisia munasolusta alkaen, eikä niiden estäminen johtanut yhtä vakaviin seurauksiin kuin CA8:n kohdalla.

CARP-geenien evoluutiohistoriaa tutkittaessa olemme löytäneet CARP X:n kaltaisia proteiineja tuottavia geenejä sukkulamadoista ja hyönteisistä, ja myös selkärangattomissa ne ilmentyvät varsinkin hermostossa. Vaikka tarkka toimintamekanismi on vielä selvittämättä, varhainen syntyhistoria, satoja miljoonia vuosia sitten, viittaisi siihen, että CARP X on tarpeellinen jossakin hyvin perustavanlaatuisessa hermosolujen toiminnassa. CARP VIII:n synty ajoittuu tutkimuksiemme mukaan myöhemmäksi eläinkunnassa, koska sitä tavataan selkärankaisten lisäksi vain ”kehittyneemmissä” selkärangattomissa, kuten nilviäisissä ja piikkinahkaisissa.

The α-carbonic anhydrases (CAs) are zinc containing metalloenzymes whose primary role is to catalyze the reversible hydration of carbon dioxide to bicarbonate and a hydrogen ion. The α-CAs are found abundantly in nature and participate in many biologically important processes apart from reversible hydration of carbon dioxide. Among the α-CA gene family, there are three homologues that have no catalytic activity due to lack of one or more of the three functionally important histidine residues and are named as carbonic anhydrase related proteins (CARPs) VIII, X and XI. Interestingly, the CARPs VIII, X, and XI are predominantly expressed in all parts of the brain in humans and mice. However, the precise physiological roles of these proteins are poorly understood.

The main aim of the present work was to perform a systematic analysis of CARPs in order to elucidate their phylogenesis, distribution, and functional role. Among the three CARPs, CARP VIII was first to be reported from the mouse complementary DNA (cDNA) library. Mutations in CA8 gene have been linked to ataxia and mental retardation in humans and mice. CARP VIII interacts with inositol tris-phosphate receptor1 (ITPR1) and might be involved in intracellular Ca 2+ signaling. Some studies have suggested that CARP X is expressed in mouse and human brain. CARP XI is also predominantly expressed in the central nervous system (CNS) and upregulation of CARP XI has been reported in some cancers.

Database searches and phylogenetic analyses showed a nearly universal distribution for CARP X-like sequences in vertebrates and invertebrates, whereas CARP VIII was limited to chordates and a few invertebrates (deuterostomes). In contrast, CARP XI is limited to vertebrates, and was found to be missing in fish and bird lineages. Surprisingly, many fish species exhibited independent duplication of CARP X sequences. Expression of CARP proteins and their messenger ribonucleic acids (mRNAs) were studied using immunohistochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), respectively. At the protein level CARP VIII demonstrated very strong expression in the cerebellum and cerebrum; moderate expression in the lung, liver, salivary gland, and stomach; and low expression in the colon and kidney. CARP X was expressed in the lung and a weak signal was observed in the kidney. Low levels of CARP XI expression was seen in the cerebellum, cerebrum, stomach, kidney, liver, and small intestine, and weak staining was also seen in the colon. RT-qPCR analyses confirmed the results of the immunohistochemical staining, showing wide distribution of Car8 and Car11 mRNAs in different tissues, whereas the expression of Car10 mRNA was restricted to the frontal cortex, parietal cortex, cerebellum, midbrain, and eye. CARPs are widely distributed with a very high sequence similarity among the organisms analyzed in the study. Distribution of CARPs and Car mRNAs suggests that these proteins may play role in brain development and motor coordination function in the cerebellum, and that they might also play some physiological role in other tissues.

The comparative analysis of human CARP VIII structure with catalytically active human CA II indicated that the surface of the CARP VIII protein molecule is highly conserved. Whether or not the conserved surface of CARP VIII is involved in interaction with ITPR1 remains to be studied in the future. The structural basis of the misfolding of the S100P mutant protein associated with ataxia can be suggested based on the crystal structure of the wild-type CARP VIII. Substitution of Ser to Pro will cause a rigid bend in the peptide backbone, which might prevent the β6 and/or the β6/β7 loop from assuming the conformations they have in the wild-type protein. Having a shorter, more constrained loop between strands β5 and β6 may amplify the problem in folding of the S100P mutant protein even further.

The presence of CARP orthologs in zebrafish led us to investigate their role by knocking down the CARP genes using antisense morpholino oligonucleotides (MOs). The expression analysis of CARP VIII in zebrafish showed that CARP VIII is expressed in the cerebellar Purkinje cells (PCs) similar to the distribution in humans. Bioinformatic analysis revealed that the CARP VIII and ITPR1 sequences are coevolved. Knockdown of CA8 gene in 0-5 day post fertilized (dpf) zebrafish embryos led to abnormal cerebellar development and ataxia in 5 dpf ca8 morphants similar to human patients with a mutation in the CA8 gene. Similarly, developmental expression of ca10a and ca10b genes suggested that these genes are required for the embryonic development in 1-5 dpf embryos. Expression studies on ca10a and ca10b genes in adult tissues suggested that these genes are highly expressed in the brain, similar to the expression pattern in human and mouse. Bioinformatic analysis revealed conserved signal peptides, N-glycosylation sites and potential disulfides, suggesting that CARP Xa and Xb proteins are secretory and potentially dimeric. Knockdown of these genes using antisense MOs led to phenotypic abnormalities in 5 dpf morphant zebrafish with gross morphological changes in the brain and ataxic movement. Our studies introduced novel zebrafish models to further investigate the mechanisms of CARP functions in vertebrates.