Characterizing and Modifying the Intestinal Barrier in Coeliac Disease

Abstract

Ohutsuolen limakalvon läpäisyeste keliakiassa

Keliakia on Suomessakin jatkuvasti yleistyvä tauti, jonka aiheuttaa viljatuotteiden sisältämä proteiini, gluteeni. Ravinnosta saatava vehnän, rukiin ja ohran gluteeni vaurioittaa keliakialle perinnöllisesti alttiiden henkilöiden ohutsuolen limakalvoa, mikä johtaa suolen tulehdustilaan ja erilaisiin suolisto-oireisiin. Lisäksi potilailla voi esiintyä monenlaisia keliakiasta johtuvia suoliston ulkopuolisia oireita ihottumasta neurologisiin ongelmiin. Keliakia voi puhjeta missä iässä tahansa ja tällä hetkellä ainoa tehokas hoito on tiukka, loppuelämän kestävä gluteeniton ruokavalio.

Keliakia kehittyy vähitellen alkaen pienistä muutoksista ohutsuolen limakalvolla päätyen pahimmassa tapauksessa ohutsuolen nukkalisäkkeiden tuhoutumiseen ja laajaan tulehdustilaan. Tämän lisäksi altistuminen gluteenille aiheuttaa keliaakikoilla vasta-aineiden muodostumista sekä elimistön omaa transglutaminaasi 2 -entsyymiä (TG2) että TG2:n muokkaamaa gluteenia vastaan. Keliakialle tyypillisiä vasta-aineita löytyy verenkierrosta ja kertyminä ohutsuolen limakalvolta. Väitöskirjatyön tavoitteena oli määrittää ohutsuolen muutoksia keliakian varhaisessa vaiheessa, mitata gluteenin ja keliakialle tyypillisten vasta-aineiden haitallisia vaikutuksia suolen limakalvoon ja sen pintakerroksen läpäisevyyteen, sekä tutkia näiden vaikutusten poistamista gluteenittomalla dieetillä ja TG2-estäjillä.

Tässä työssä gluteenin vaikutuksia suolen pintakerrokseen tutkittiin käyttämällä sekä potilasnäytteitä että soluviljelymallia. Keliakiapotilaista otettiin verinäytteitä ja koepaloja ohutsuolen limakalvolta ennen suolinukan häviämistä, aktiivisen taudin aikana ja vuosi gluteenittoman dieetin aloittamisen jälkeen. Tutkimustulosten perusteella suolen pinnalla olevien epiteelisolujen välisissä liitoksissa näkyi vaurioita jo keliakian varhaisessa vaiheessa, vaikka suolen nukkarakenne oli vielä normaali. Lisäksi veri- ja ohutsuolinäytteistä löytyi keliakialle tyypillisiä vasta-aineita ja suolen tulehdusta osoittavat solut olivat lisääntyneet. Kun keliakia oli edennyt vaiheeseen, jossa limakalvo oli muuttunut litteäksi suolinukan tuhouduttua, myös epiteelikerroksessa olevien liitosproteiinien määrät pysyivät edelleen alhaisina. Gluteeniton dieetti puolestaan käynnisti liitosten korjaantumisen, tulehdussolujen vähenemisen ja vasta-aineiden häviämisen.

Suolen pintakerroksen läpäisevyyden tutkimiseen käytettiin ihmisperäisiä Caco-2-soluja, jotka muodostavat suolen epiteelin kaltaisen yhtenäisen solukerroksen. Kokeita varten vehnän gluteenista peräisin oleva gliadiini pilkottiin ruoansulatusentsyymien avulla pienemmiksi osiksi, peptideiksi, kuten ruoansulatusprosessissa elimistössäkin tapahtuu. Pilkottu gliadiini lisäsi Caco-2-solukerroksen läpäisevyyttä vaurioittamalla solujen välisiä liitoksia. Yllättävää kyllä, kokeissa havaittiin myös, että keliaakikkojen seerumeista eristetyt IgA-luokan vasta-aineet edistivät eräiden gliadiinipeptidien kulkeutumista pintasolukerroksen läpi. Keliaakikkojen IgA ei kuitenkaan rikkonut solujen välisiä liitoksia, mikä viittaa siihen, että gliadiinipeptidien kulkeutuminen epiteelin läpi IgA:n avulla tapahtui mahdollisesti solujen kautta eikä niiden välistä. Lisäksi keliaakikkojen vasta-aineet näyttivät lisäävän soluissa olevan TG2:n aktiivisuutta, mikä puolestaan voitiin poistaa TG2-estäjämolekyylillä. Kyseisellä TG2-estäjällä voitiin poistaa myös keliaakikon vasta-aineiden vaikutus gliadiinipeptidien kulkeutumiseen epiteelisolukerroksen läpi. Lisäksi havaittiin, että solujen esikäsittely TG2-estäjillä vähensi gliadiinin aiheuttamia vaurioita solun tukirangassa ja solujen välisissä liitoksissa sekä esti läpäisevyyden lisääntymistä. Epiteelisoluissa nähtyjen myönteisten muutosten lisäksi TG2-estäjät vähensivät gliadiinin aiheuttamia haitallisia vaikutuksia keliaakikoilta otetuissa ohutsuolikoepaloissa, joissa esimerkiksi tulehdusta osoittavien imusolujen määrät vähenivät.

Tässä väitöskirjatyössä havaittiin, että jo alkavassa keliakiassa suolen limakalvon eheydessä näkyy vaurioita epiteelisolujen välisissä liitoksissa, mikä johtaa suolen läpäisevyyden lisääntymiseen ja mahdollisiin suolisto-oireisiin. Keliaakikkojen IgA-luokan vasta-aineet voivat edelleen edistää gluteenin kulkeutumista suolen pintakerroksen läpi ja siten lisätä gluteenin haittavaikutuksia. Toisaalta solu- ja koepalaviljelyistä saatujen tulosten perusteella gluteenin aiheuttamia haitallisia vaikutuksia voidaan vähentää TG2-estäjillä, joita onkin ehdotettu yhdeksi mahdolliseksi hoitovaihtoehdoksi gluteenittoman dieetin rinnalle. Lisätutkimuksia kuitenkin tarvitaan tähän liittyen.

Väitöskirjatyön tutkimustulokset tuovat uutta tietoa keliakian kehittymisestä suolen limakalvolla ja tarjoavat mahdollisuuksia uusien hoitomuotojen kehittämiseen.

An impairment of the epithelial barrier has been shown to be a critical determinant in intestinal inflammation and several gastrointestinal malfunctions, including coeliac disease. Coeliac disease is an autoimmune-mediated disorder triggered by dietary gluten and related prolamines from wheat, rye and barley in genetically susceptible individuals. The condition develops from minor changes in the small-bowel mucosa to damage with villus atrophy, crypt hyperplasia and massive inflammation. An immune response to ingested gluten results in the formation of antibodies against both transglutaminase 2 (TG2) and deamidated forms of gluten-derived gliadin peptides. These antibodies are found in the circulation and anti-TG2 antibodies also as deposits in the small-bowel mucosa. In coeliac patients the ingestion of gluten triggers a wide spectrum of clinical manifestations, including intestinal and extraintestinal symptoms. At this moment the only effective treatment for coeliac disease is a strict and life-long gluten-free diet. In this investigation of gluten-induced damage in coeliac patients, small-bowel mucosal biopsies were taken before the development of villus atrophy, during overt disease and one year after the initiation of a gluten-free diet. Immunohistochemical staining revealed the expression of intestinal epithelial junction proteins to be disrupted in the early stages of the disease, although the villus structure was still normal. When coeliac disease progressed to the stage of damaged mucosa, the expression of junction proteins remained low. Junction protein expression started to normalize during a gluten-free diet. A human Caco-2 cell monolayer served as an in vitro model for intestinal epithelial permeability experiments. Pepsin-trypsin (PT)-digested gliadin caused a breakdown of this barrier and increased the permeability of the cell monolayer, observed as a lower transepithelial resistance (TER) and increased flux of fluorescently-labelled dextran molecules when compared to control samples. Interestingly, treatment of Caco-2 cells with IgA class antibodies derived from coeliac patients enhanced the translocation of labelled gluten-derived gliadin peptides through the epithelial cell layer. According to measurements of TER, coeliac IgA had no effect on paracellular permeability, suggesting that translocation of gliadin peptides occurs transcellularly rather than by paracellular route. In addition, coeliac antibodies increased TG2 activity in Caco-2 cells, which effect could be prevented by treatment with a TG2 inhibitor, R281. This TG2 inhibitor also prevented coeliac antibody-induced translocation of gliadin peptides. In addition, TER measurements showed that TG2 inhibitors R281 and R283 prevented the PT-gliadin-induced increase in permeability. Fluorescence staining of Caco-2 cells showed PT-gliadin-induced disruptions of the cell cytoskeleton and junction proteins to be reduced by pre-treatment with TG2 inhibitors. In addition to the effects on gliadin-induced alterations in the epithelium, TG2 inhibitors prevented the PT-gliadin-induced increase in the number of CD25-positive lymphocytes, IL-15-positive cells, regulatory T cells and proliferative crypt enterocytes in coeliac patient-derived small-bowel mucosal biopsies. This study showed that the integrity of the small-bowel mucosal epithelium is already impaired in early developing coeliac disease, as shown by the disruption of junctions between epithelial cells, although villus structure was still normal. Permeability experiments suggested that IgA-class antibodies from coeliac patients enhanced the translocation of harmful gliadin peptides through the intestinal epithelium. This effect could be prevented by inhibition of TG2. Furthermore, TG2-inhibitors reduced or removed many PT-gliadin-induced effects in an intestinal epithelial cell model and cultured biopsies. These findings reveal new aspects of the pathogenesis of coeliac disease in the intestinal mucosal epithelium and offer opportunities for developing new therapies for the disorder.