Characterisation of dopamine neurons of the murine ventral tegmental area in primary culture and acute dissociations

Abstract

Dopamine (DA) neurons play pivotal roles in the regulation of motor and endocrine functions, as well as affective and cognitive behaviours. The degeneration and dysregulation of these neurons has been linked to the pathophysiology of several neurodegenerative, neurodevelopmental and psychiatric diseases, as well as genetic disorders. In the mammalian brain, neurons that synthesise and release DA are distributed to distinct major A16-A8 nuclei and smaller subnuclei labelled vlPAG and DRN. The aim in this project was to investigate the distribution of these neurons by creating an expression map of perfused brain samples from young and adult animals derived from a transgenic Th-EGFP mouse line in which DA neurons were visually identified. The results indicated that 3-week-old animals show mature DA neuron distribution and thus present the possibility to conduct experiments with these young adolescent animals.

Emphasis of this project was on the DA neurons of the ventral tegmental area (VTA) with projections constituting the mesocorticolimbic system. This pathway is regarded as a critical regulator of reward and goal-directed behaviour. The second aim of the project was to compare pre-existing methods of primary co-culture and acute mechanical dissociations to set up an in vitro model for VTA DA neurons. The results showed that a higher yield of viable neurons is obtained with the primary culture particularly, when astrocytes (that are required for growth support) are enriched through cold wash and neurons are purified without centrifugation and the cultures are supplemented with glial derived neurotropic factor (GDNF).

Excitatory glutamatergic modulation of VTA is suggested to regulate important functions of synaptic plasticity, which have been associated with learning and memory. Here, currents mediated by the glutamate-gated ion channels were investigated by applying glutamate to patched neurons and recording the responses in whole-cell mode. The acquired traces resembled the currents mediated by AMPA-type glutamate receptors. In summary, primary astrocyte neuron co-culture combined with the Th-EGFP mouse strain is an excellent in vitro model for studying VTA physiology, and albeit statistical analysis remains to validate the appropriate reproducibility of the protocol, the initial results on glutamate responses suggest that such methodology was successfully set up during the course of this thesis.

Hiiren aivojen ventraalisen tegmentaalisen alueen dopaminergisten hermosolujen karakterisointi primaariviljelmällä ja akuutilla eristysmenetelmällä

Dopaminergiset hermosolut säätelevät liikunnallisia, endokriinisiä ja kognitiivisia toimintoja. Näiden hermosolujen rappeutumisen ja häiriintyneen säätelyn uskotaan vaikuttavan useiden solujen kehitykseen ja rappeutumiseen liittyvien neurologisten oireyhtymien, sekä tiettyjen psykiatristen ja geneettisten sairauksien syntyyn. Nisäkkäillä, dopamiinia valmistavat ja vapauttavat solut on jaettu erilisiin A16-A8-pääryhmiin, sekä pienempiin vlPAG- ja DRN-alaryhmiin. Tämän työn tarkoitus oli tutkia näiden solujen levinneisyyttä ilmentymiskartan avulla, joka tehtiin nuorista ja vanhoista transgeenisen Th-EGFP -kannan hiiristä, jossa dopamiinisolut ovat tunnistettavissa visuaalisesti. Tulokset osoittavat, että 3 viikon ikäisillä hiirillä dopaminergisten hermosolujen levinneisyys on aikuisten hiirten kaltainen, jolloin olisi mahdollista tehdä kokeita myös nuoremmilla eläimillä.

Tutkielman pääpaino oli A10-pääryhmässä, jonka hermosolut ovat ventraalisella tegmententaalisella alueella (VTA). Näiden solujen hermorata muodostaa kohdealueineen mesokortikolimbisen järjestelmän, joka tunnetaan myös aivojen palkkioradan osana. Työn toinen tarkoitus oli verrata olemassa olevia primaarisia soluviljelymalleja sekä akuutteja mekaanisia eristyksiä VTA:n dopamiini hermosoluille. Tulokset osoittivat että hyväkuntoisten dopamiinisolujen saanto on suurempi soluviljelymallilla, varsinkin kun astrosyyttejä (jotka toimivat tukisoluina) rikastetaan kylmän liuospesun avulla ja hermosolut puhdistetaan ilman sentrifugointia ja viljelmille lisätään GDNF-kasvutekijää.

VTA:n dopamiinisolujen aktiivaatio lisää glutamaatti-välitteisen hermosäätelyn määrää pitkäaikaisesti (ns. pitkäaikaisvahvistuminen engl. long-term potentiation), mikä on hermostossa yleisesti otaksuttu perusta kognitiivisille tapahtumille, kuten muistamiselle ja oppimiselle. Tässä tutkimuksessa glutamaatista riippuvaisten ionikanavien vasteita tutkittiin sähköfysiologisin menetelmin. Mittausten tulokset muistuttivat AMPA-tyyppisten glutamaattireseptorien välittämiä virtauksia. Yhteenvetona voidaan todeta, että primaarinen astrosyyttien ja hermosolujen yhteisviljelmä on erinomainen in vitro -malli VTA:n fysiologian tutkimiseen ja huolimatta puuttuvasta tilastollisesta validoinnista, alustavat glutamaattimittaukset viittaavat siihen, että metodi pystytettiin onnistuneesti tämän työn aikana.