Functional Characterization of the Kinase and Pseudokinase Domains in the Janus Tyrosine Kinase (JAK) 2

Abstract

Hematopoieesin eli verenmuodostuksen aikana liukoiset sytokiinimolekyylit säätelevät tarkasti solujen kasvua ja erilaistumista. Sytokiinit aktivoivat JAK/STAT-signaalinvälitysreitin, jolla on merkittävä rooli verisolujen kehityksessä. Sytokiinit ja JAK/STAT-reitti vaikuttavat myös immuunisolujen kehittymiseen ja toimintaan. Sytokiinien sitoutuminen solun pintareseptoreihin aktivoi JAK-proteiineja, jotka fosforyloivat reseptorin solunsisäisen osan tyrosiinitähteitä, joihin STAT-proteiinit sitoutuvat. JAKit fosforyloivat seuraavaksi STATit, jotka siirtyvät tumaan dimeereinä ja osallistuvat geenien ilmentymisen säätelyyn. JAK-proteiineilla on useasta domeenista (JH1-7) koostuva rakenne. JH1-domeenissa on katalyyttinen kinaasi- eli fosforylaatioaktiivisuus, JH2 on pseudokinaasidomeeni ja FERM ja SH2-domeenit (JH3-JH7) säätelevät mm. vuorovaikutusta reseptorin kanssa.

Janus-kinaasi 2 (JAK2) on JAK-proteiiniperheen jäsen, jolla on merkittävä rooli niin nisäkkäiden yksilönkehityksessä kuin myös sairauksissa. JAK2-proteiinin aktiivisuutta säädellään usealla tasolla, joista ensimmäinen on vuorovaikutus säätelymolekyylien kanssa. Toinen säätelyn taso on JAK2-proteiinin post-translationaaliset muokkaukset (mm. fosforylaatio). Lisäksi JAK2:n pseudokinaasidomeenilla (JH2) ja molekyylivuorovaikutuksia välittävällä FERM-osalla on aktiivisuutta sääteleviä vaikutuksia.

Väitöskirjatyön tavoitteena oli selvittää JAK2-proteiinin aktiivisuuden säätelyä post-translationaalisten muokkausten ja JH2-pseudokinaasidomeenin osalta, sekä tutkia JH1- ja JH2-domeenien ATP-sitomiskykyä. Lisäksi pyrittiin valottamaan JH2-domeeniin kohdistuvien patogeenisten mutaatioiden vaikutusmekanismia käyttäen esimerkkinä V617F-mutaatiota, joka on tyypillinen polysytemia vera -potilailla.

Jo ennestään on ollut tiedossa, että JH2-domeeni säätelee JAK2-proteiinin aktiivisuutta hillitsemällä sitä, mutta säätelyn mekanismi ei ole ollut selvillä. Vaikka JH2-domeenin aminohapposekvenssi on hyvin samankaltainen JH1-kinaasidomeenin kanssa, siitä puuttuu useita ratkaisevan tärkeinä pidettyjä aminohappoja ja siksi sen on oletettu olevan katalyyttisesti inaktiivinen. Kun JH2-domeenin toimintaa tutkittiin lähemmin, havaittiin että se on ennakko-oletuksista poiketen katalyyttisesti aktiivinen kinaasi. Lisäksi tunnistettiin kaksi fosforylaation kohdetta, aminohapot seriini-523 ja tyrosiini-570. JH1-domeenin havaittiin sitovan ATP:a tiukasti, ja tälle sitoutumiselle määritettiin dissosiaatiovakio (Kd). Tässä tutkimuksessa kehitettiin menetelmä, jolla on mahdollista tutkia minkä tahansa kinaasin ATP-sitomiskykyä. Tarkempi biokemiallinen karakterisointi suoritettiin JAK2-kinaasidomeeneille (JH1 ja JH2). Fosforylaatiokinetiikka, fosforylaatiomekanismi sekä kohdepeptidit määritettiin JH1- ja JH1–JH2-osille. JH2-domeenin mukanaolo vähensi JH1–JH2-osan ATP-sitomiskykyä kymmenkertaisesti, mikä vaikuttaa JAK2-aktiivisuuteen heikentävästi. V617F-mutaation havaittiin vaikuttavan fosforylaatiokinetiikkaan.

Väitöskirjatutkimuksen tulokset tuovat lisää tietoa JAK2-proteiinin säätelystä molekyylitasolla. Tulokset luovat biokemiallisen ja funktionaalisen perustan JAK2-proteiinin ATP-sitomiskykyyn kohdistuvien terapeuttisten sovellusten kehittämiselle.

Hematopoiesis or blood formation requires the controlled coordination of cell proliferation and differentiation through the action of soluble cytokines. The cytokines activate the Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT) signal transduction pathway, which plays a major role in the development of blood cells. Cytokines and the JAK/STAT pathway also affect growth and development of immune cells. Cytokines’ binding to the cell surface receptors activate JAK proteins which further phosphorylate the tyrosine residues of the receptor in the intracellular portion. This facilitates the STAT proteins to bind to the receptors. JAKs phosphorylate the STATs, allowing it to form dimers, which finally translocate to the nucleus and participate in gene expression regulation. JAK proteins have multiple domains named from JH1 to JH7. JH1 is the catalytic domain of the kinase through which protein is said to be activated when it gets phosphorylated, JH2 or pseudokinase domain, SH2 and FERM domains (JH3 - JH7). JAKs bind to the receptor via the FERM domain.

Janus kinase 2 (JAK2) is a JAK protein family member which has a significant role in mammalian development and diseases. JAK2 protein activity is regulated at several levels, the first of which is interaction with regulatory molecules. The second level is the control of the JAK2 protein post- translational modification (such as phosphorylation). In addition, regulation through the involvement of JAK2 pseudokinase domain (JH2) and the FERM domain forms third and fourth level respectively.

The aim of the doctoral thesis was to examine the regulation of the JAK2 at post-translational modifications, and through the involvement of both JH1 and JH2 domains, and to examine the JH1 and JH2 domains’ ATP- binding capacity. In addition, this study shed light on JH2’s action against pathogenic mutations taking V617F mutation as an example, which is representative of 95% of polycythemia vera patients.

Already it has been known that the JH2 domain of JAK2 protein regulates the activity by inhibiting the JH1 activity, but the control mechanism has not been clarified. Although the JH2 domain amino acid sequence is very similar to the kinase domain JH1, it lacks a number of amino acids considered as critical and therefore is presumed to be catalytically inactive. When the JH2 domain activity was examined more closely, it was found that it is active, like the catalytically active kinase. In addition, phosphorylation was identified on two amino acids serine -523 and tyrosine -570. JH1 domain was found to bind ATP tightly, and this binding was determined by its dissociation constant (Kd). In this study, a method was developed, making it possible to examine any kinase- ATP binding capacity. A more detailed biochemical characterization was carried out with tandem JAK2 kinase domain (JH1 and JH2). Phosphorylation kinetics and peptide substrate preferences were determined by JH1 and JH1-JH2 - proteins. JH2 domain reduced the JH1-JH2’s affinity for ATP up to 10 fold, which negatively affects the activity of JAK2. V617F mutation was found to increase the maximum velocity of JAK2 kinase. The results indicated that the small linker region between SH2 and JH2 also participates in the JAK2 inhibition by reducing the affinity for ATP.

The results of this research will bring more information about the JAK2 protein regulation at the molecular level. These results provide biochemical and functional basis for the JAK2 protein regulation with respect to ATP - binding capacity and this will help to design and develop therapeutic molecules for curing many diseases implicated in dysregulation JAK2 signaling.