Avidiini- ja AVR4/5-geenien ilmentymisen tutkiminen kaksoismolekyylimajakka-FRET-menetelmällä
KOHO, TIIA (2007)
2007
Biokemia - Biochemistry
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2007-03-14
Julkaisun pysyvä osoite on
http://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-16653
http://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-16653
Tiivistelmä
Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Kanan avidiini (AVD) ja avidiinin kaltaiset geenit 17 (AVR:t 17) kuuluvat samaan geeniperheeseen. AVD-geenin ilmentymistä on aikaisemmin tutkittu proteiinitasolla, ja sen tiedetään ilmentyvän toisaalta progesteronisäätelyn alaisuudessa ja toisaalta tulehduksen tai kudosvaurion indusoimana. Ilmentymisen säätelyn molekyylitason yksityiskohtia ei kuitenkaan tunneta. AVR-geenien ilmentymistä on tutkittu vasta alustavasti. Kaksoismolekyylimajakka-FRET-koettimet (dual FRET molecular beacons) ovat erittäin herkkä ja vähäisen taustasignaalin tuottava menetelmä, joka mahdollistaa spesifisen kohdegeenin ilmentymisen ja lokalisaation tutkimisen sekä kvantitatiivisen mittaamisen reaaliajassa elävissä soluissa. Tutkimuksen päätavoitteina olivat kaksoismolekyylimajakka-FRET-menetelmän kehittäminen AVD- ja AVR4/5-geenien ilmentymisen ja lokalisaation tutkimiseen elävissä soluissa sekä kvantitatiivisen RT-PCR -menetelmän kehittäminen AVD- ja AVR4/5-geenien ilmentymisen mittaamiseen.
Tutkimusmenetelmät: AVD- ja AVR4/5-mRNA:ta tuotettiin bakulovirus-tuottosysteemin avulla hyönteissoluissa. Tuoton onnistuminen varmistettiin proteiinitasolla Western blotilla; RNA-tasolla agaroosigeelillä ja tavallisella RT-PCR:llä. mRNA-pitoisuudet määritettiin absoluuttisesti kvantitatiivisella reaaliaikaisella RT-PCR:llä. AVD:n ja AVR4/5:n mRNA:n kuvantaminen elävissä soluissa tehtiin kaksoismolekyylimajakoiden avulla, jotka kuljetettiin soluihin elektroporaatiolla. Elävät solut kuvattiin elävien solujen fluoresenssimikroskoopilla.
Tutkimustulokset: AVD- ja AVR-proteiinien sekä mRNA:iden tuotto hyönteissoluissa onnistui. Avidiinin mRNA-pitoisuus kasvoi infektion edetessä sekä tavallisessa että kvantitatiivisessa RT-PCR:ssä. AVR4/5:n kohdalla ei voitu havaita samanlaista kasvua, minkä lisäksi menetelmien tuloksissa oli ristiriitaa. Kaksoismolekyylimajakkaparien signaalitausta-suhde oli in vitro -kokeissa huono, mutta FRET-tehokkuus hyvä. Kaksoismolekyylimajakat lokalisoituivat elävissä soluissa tumaan, mikä ei todennäköisesti vastannut oikean kohteen lokalisaatiota. Luovuttajamolekyylimajakan epäspesifinen taustasignaali väheni FRET-signaalissa.
Johtopäätökset: AVD- ja AVR4/5-geenien ilmentymisen mittaaminen kvantitatiivisella RT-PCR -menetelmällä onnistui, ja menetelmää voidaan jatkossa hyödyntää AVD- ja AVR-geenien ilmentymisen tutkimisessa. Kaksoismolekyylimajakoiden tumalokali-saation syynä elävissä soluissa oli todennäköisesti käytössä ollut liian suuri koetinpitoisuus. Menetelmää varten joudutaan vielä tekemään lisäkokeita.
Asiasanat: geeni-ilmentyminen, molekyylimajakka, fluoresenssi, FRET, kvantitatiivinen RT-PCR, mRNA
Tutkimusmenetelmät: AVD- ja AVR4/5-mRNA:ta tuotettiin bakulovirus-tuottosysteemin avulla hyönteissoluissa. Tuoton onnistuminen varmistettiin proteiinitasolla Western blotilla; RNA-tasolla agaroosigeelillä ja tavallisella RT-PCR:llä. mRNA-pitoisuudet määritettiin absoluuttisesti kvantitatiivisella reaaliaikaisella RT-PCR:llä. AVD:n ja AVR4/5:n mRNA:n kuvantaminen elävissä soluissa tehtiin kaksoismolekyylimajakoiden avulla, jotka kuljetettiin soluihin elektroporaatiolla. Elävät solut kuvattiin elävien solujen fluoresenssimikroskoopilla.
Tutkimustulokset: AVD- ja AVR-proteiinien sekä mRNA:iden tuotto hyönteissoluissa onnistui. Avidiinin mRNA-pitoisuus kasvoi infektion edetessä sekä tavallisessa että kvantitatiivisessa RT-PCR:ssä. AVR4/5:n kohdalla ei voitu havaita samanlaista kasvua, minkä lisäksi menetelmien tuloksissa oli ristiriitaa. Kaksoismolekyylimajakkaparien signaalitausta-suhde oli in vitro -kokeissa huono, mutta FRET-tehokkuus hyvä. Kaksoismolekyylimajakat lokalisoituivat elävissä soluissa tumaan, mikä ei todennäköisesti vastannut oikean kohteen lokalisaatiota. Luovuttajamolekyylimajakan epäspesifinen taustasignaali väheni FRET-signaalissa.
Johtopäätökset: AVD- ja AVR4/5-geenien ilmentymisen mittaaminen kvantitatiivisella RT-PCR -menetelmällä onnistui, ja menetelmää voidaan jatkossa hyödyntää AVD- ja AVR-geenien ilmentymisen tutkimisessa. Kaksoismolekyylimajakoiden tumalokali-saation syynä elävissä soluissa oli todennäköisesti käytössä ollut liian suuri koetinpitoisuus. Menetelmää varten joudutaan vielä tekemään lisäkokeita.
Asiasanat: geeni-ilmentyminen, molekyylimajakka, fluoresenssi, FRET, kvantitatiivinen RT-PCR, mRNA