Human Adipose Stromal Cell Angiogenesis Assay: Development of Stimulation Medium and Set-up of Cell Characterization
HUTTALA, OUTI (2013)
2013
Biokemia - Biochemistry
Biolääketieteellisen teknologian yksikkö - Institute of Biomedical Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2013-01-23
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-23471
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-23471
Tiivistelmä
Tutkimuksen tausta ja tavoitteet
Angiogeneesi eli uusien verisuonien muodostus on keskeistä monissa sairauksissa kuten syövässä, silmäsairauksissa ja reumassa. Lisäksi se on sikiönkehityksen avaintapahtumia. Tästä syystä kemikaalien aiheuttamat muutokset verisuonten muodostukseen voivat olla joko on erittäin haitallisia ja positiivisia. Angiogeneesimalli on siis erittäin tarpeellinen lääkeainekehityksessä ja yleisessä kemikaalin haitallisuusarvioinneissa.
Tutkimuksen tavoitteena oli löytää kasvatusliuos, jolla aikaan saadaan (ihmisen) rasvan kantasoluihin pohjautuvan angiogeneesimallin verisuonten muodostus sekä pystyttää solujen karakterisointia varten virtaussytometrinen menetelmä.
Tutkimusmenetelmät
Tutkimuksessa mallinnettiin verisuonten muodostusta viljelemällä rasvan kantasoluja ja napanuoralaskimon endoteelisoluja yhteisviljelmässä 6-13 päivää. Tutkimuksessa testattiin erilaisia kasvatusliuoksia, jotka sisälsivät eri kasvutekijöitä, ravinteita ja seerumin pitoisuuksia. Soluviljelmät värjättiin useilla vasta-aineilla (von Willebrand tekijä, kollageeni IV, CD144, kalponiini, sileälihasmyosiini ja -aktiini).Viljelmiä tutkittiin käänteis- ja konfokaalimikroskoopilla sekä soluanalyysilaitteella (Cell IQ). Verisuonenmuodostusta arvioitiin manuaalisesti sekä automatisoiduilla analyysimenetelmillä. Kontrollina toimi tähän asti käytetty kaupallinen endoteelien kasvatusliuos (EGM-2). Virtaussytometrinen menetelmä optimoitiin ja testattiin. Tätä varten solut käsiteltiin CD144, CD309, CD73, eNOS ja VWF-A2:ään sitoutuvilla vasta-aineilla. Analysointiin käytettiin FACSCanto II (BD) -virtaussytometriä ja FACSDiva -ohjelmaa.
Tutkimustulokset
Tutkimuksissa havaittiin että kantasoluangiogeneesimalli tuotti tasaisen kolmiulotteisen toistettavan verisuonituksen parhaiten seerumittomassa ympäristössä. Paras verisuonimuodostus havaittiin kasvatusliuoksessa, joka sisälsi DMEM/F12, BSA, L-glutamiini, T3, natriumpyruvaatti, ITS, VEGF, FGF-β, hydrokortisoni ja askorbiinihappo (C-vitamiini). Näistä välttämättömiä olivat VEGF ja FGF-β ja lisäksi askorbiinihappon (200-350 μg/ml) ja hydrokortisonin (0,2-1 μg/ml) lisääminen paransi verisuonten muodostusta. Virtaussytometriassa rasvan kantasolut havaittiin positiivisiksi CD73:n suhteen ja endoteelit CD144, CD309, VWF-A2, CD73 ja eNOS positiivisiksi.
Johtopäätökset
Tutkimuksissa kehitettiin uusi osakomponenteiltaan tarkasti tunnettu stimulaatiokasvatusliuos korvaamaan kaupallinen EGM-2-kasvatusliuos. Tätä voidaan tulosten pohjalta muokata paremmin esimerkiksi kolmansille soluille sopivaksi stimulointiympäristöksi. Solujen karakterisointi todisti endoteelien tuottavan niille ominaisia proteiineja sekä rasvan kantasolujen kantasolumarkkeria CD73
Angiogeneesi eli uusien verisuonien muodostus on keskeistä monissa sairauksissa kuten syövässä, silmäsairauksissa ja reumassa. Lisäksi se on sikiönkehityksen avaintapahtumia. Tästä syystä kemikaalien aiheuttamat muutokset verisuonten muodostukseen voivat olla joko on erittäin haitallisia ja positiivisia. Angiogeneesimalli on siis erittäin tarpeellinen lääkeainekehityksessä ja yleisessä kemikaalin haitallisuusarvioinneissa.
Tutkimuksen tavoitteena oli löytää kasvatusliuos, jolla aikaan saadaan (ihmisen) rasvan kantasoluihin pohjautuvan angiogeneesimallin verisuonten muodostus sekä pystyttää solujen karakterisointia varten virtaussytometrinen menetelmä.
Tutkimusmenetelmät
Tutkimuksessa mallinnettiin verisuonten muodostusta viljelemällä rasvan kantasoluja ja napanuoralaskimon endoteelisoluja yhteisviljelmässä 6-13 päivää. Tutkimuksessa testattiin erilaisia kasvatusliuoksia, jotka sisälsivät eri kasvutekijöitä, ravinteita ja seerumin pitoisuuksia. Soluviljelmät värjättiin useilla vasta-aineilla (von Willebrand tekijä, kollageeni IV, CD144, kalponiini, sileälihasmyosiini ja -aktiini).Viljelmiä tutkittiin käänteis- ja konfokaalimikroskoopilla sekä soluanalyysilaitteella (Cell IQ). Verisuonenmuodostusta arvioitiin manuaalisesti sekä automatisoiduilla analyysimenetelmillä. Kontrollina toimi tähän asti käytetty kaupallinen endoteelien kasvatusliuos (EGM-2). Virtaussytometrinen menetelmä optimoitiin ja testattiin. Tätä varten solut käsiteltiin CD144, CD309, CD73, eNOS ja VWF-A2:ään sitoutuvilla vasta-aineilla. Analysointiin käytettiin FACSCanto II (BD) -virtaussytometriä ja FACSDiva -ohjelmaa.
Tutkimustulokset
Tutkimuksissa havaittiin että kantasoluangiogeneesimalli tuotti tasaisen kolmiulotteisen toistettavan verisuonituksen parhaiten seerumittomassa ympäristössä. Paras verisuonimuodostus havaittiin kasvatusliuoksessa, joka sisälsi DMEM/F12, BSA, L-glutamiini, T3, natriumpyruvaatti, ITS, VEGF, FGF-β, hydrokortisoni ja askorbiinihappo (C-vitamiini). Näistä välttämättömiä olivat VEGF ja FGF-β ja lisäksi askorbiinihappon (200-350 μg/ml) ja hydrokortisonin (0,2-1 μg/ml) lisääminen paransi verisuonten muodostusta. Virtaussytometriassa rasvan kantasolut havaittiin positiivisiksi CD73:n suhteen ja endoteelit CD144, CD309, VWF-A2, CD73 ja eNOS positiivisiksi.
Johtopäätökset
Tutkimuksissa kehitettiin uusi osakomponenteiltaan tarkasti tunnettu stimulaatiokasvatusliuos korvaamaan kaupallinen EGM-2-kasvatusliuos. Tätä voidaan tulosten pohjalta muokata paremmin esimerkiksi kolmansille soluille sopivaksi stimulointiympäristöksi. Solujen karakterisointi todisti endoteelien tuottavan niille ominaisia proteiineja sekä rasvan kantasolujen kantasolumarkkeria CD73