IMPROVED PHAGE DISPLAY METHODS FOR THE SELECTION OF DNA-SHUFFLED AVIDIN MUTANTS
RAHIKAINEN, ROLLE (2012)
RAHIKAINEN, ROLLE
2012
Biokemia - Biochemistry
Biolääketieteellisen teknologian yksikkö - Institute of Biomedical Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2012-05-23
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-22502
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-22502
Tiivistelmä
Tutkielman tausta ja tavoitteet: Faagiseulonta on proteiinikirjastojen seulonnassa käytetty menetelmä, jonka avulla proteiineja ja peptidejä voidaan valikoida niiden ligandinsitomiskyvyn tai muiden biokemiallisten ominaisuuksien perusteella. Faagien epäspesifinen sitoutuminen ja faagien epätasaisen eluoitumisen aiheuttama vääristymä saattavat kuitenkin estää erittäin korkealla affiniteetilla ligandiinsa sitoutuvien proteiinien seulonnan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida seitsemän erilaisen faagiseulontamenetelmän soveltuvuutta DNA:n sekoituksella valmistettujen avidiinimutanttien seulontaan.
Materiaalit ja menetelmät: DNA:n sekoituksella valmistettuja AVD/AVR2, AVD/BBP-A ja AVR2/BBP-A kirjastoja seulottiin 3 - 5 kertaa erilaisilla faagiseulontamenetelmillä. Kaikissa testatuissa menetelmissä käytettiin disulfidisidoksen sisältävää biotiinikonjugaattia, joka mahdollistaa biotiiniin sitoutuneiden faagien ei-selektiivisen eluoimisen DTT-käsittelyn avulla. Lisäksi erilaisia apuaineita ja esikäsittelyjä testattiin faagien epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Faagiseulonnassa rikastuneiden avidiiniproteiinien ominaisuuksia tutkittiin faagi-ELISA-menetelmällä ja avidiinimutanttien dissosiaationopeusvakioiden vertailun mahdollistavalla testillä.
Tulokset: Tässä työssä kuvattujen uusien faagiseulontamenetelmien käyttäminen johti joidenkin aikaisemmin tuntemattomien avidiinimutanttien rikastumiseen. Alustavissa toiminnallisuutta arvioivissa tutkimuksissa monet näistä mutanteista dissosioituivat suhteellisen hitaasti alustaan sidotusta biotiinista. Toisaalta esimerkiksi villityypin avidiinia, AVR2:ta tai BBP-A:ta esittelevien faagien rikastumista ei havaittu. Lisäksi tässä työssä kehitetty kuoppalevymenetelmä osoittautui tehokkaaksi ja toistettavaksi menetelmäksi avidiinimutanttien valikointiin niiden dissosiaationopeuksien perusteella.
Johtopäätökset: Muokattuja faagiseulontamenetelmiä käytettiin tässä työssä onnistuneesti uusien, ominaisuuksiltaan lupaavien avidiinimutanttien seulonnassa. Erittäin tiukasti biotiiniin sitoutuvien avidiinimutanttien rikastumista ei kuitenkaan havaittu, mikä saattaa johtua faagien epäspesifisestä sitoutumisesta ja erilaisia avidiinimutantteja esittelevien faagien erilaisista tuottotasoista bakteerisoluissa. Tästä huolimatta tässä työssä esitetyt menetelmät ja tulokset antavat vankan pohjan avidiinimutanttien faagiseulonnassa käytettyjen menetelmien kehittämiselle.
Asiasanat:Faagiseulonta, avidiini, AVR2, BBP-A, D-biotiini, DNA:n sekoitus
Materiaalit ja menetelmät: DNA:n sekoituksella valmistettuja AVD/AVR2, AVD/BBP-A ja AVR2/BBP-A kirjastoja seulottiin 3 - 5 kertaa erilaisilla faagiseulontamenetelmillä. Kaikissa testatuissa menetelmissä käytettiin disulfidisidoksen sisältävää biotiinikonjugaattia, joka mahdollistaa biotiiniin sitoutuneiden faagien ei-selektiivisen eluoimisen DTT-käsittelyn avulla. Lisäksi erilaisia apuaineita ja esikäsittelyjä testattiin faagien epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Faagiseulonnassa rikastuneiden avidiiniproteiinien ominaisuuksia tutkittiin faagi-ELISA-menetelmällä ja avidiinimutanttien dissosiaationopeusvakioiden vertailun mahdollistavalla testillä.
Tulokset: Tässä työssä kuvattujen uusien faagiseulontamenetelmien käyttäminen johti joidenkin aikaisemmin tuntemattomien avidiinimutanttien rikastumiseen. Alustavissa toiminnallisuutta arvioivissa tutkimuksissa monet näistä mutanteista dissosioituivat suhteellisen hitaasti alustaan sidotusta biotiinista. Toisaalta esimerkiksi villityypin avidiinia, AVR2:ta tai BBP-A:ta esittelevien faagien rikastumista ei havaittu. Lisäksi tässä työssä kehitetty kuoppalevymenetelmä osoittautui tehokkaaksi ja toistettavaksi menetelmäksi avidiinimutanttien valikointiin niiden dissosiaationopeuksien perusteella.
Johtopäätökset: Muokattuja faagiseulontamenetelmiä käytettiin tässä työssä onnistuneesti uusien, ominaisuuksiltaan lupaavien avidiinimutanttien seulonnassa. Erittäin tiukasti biotiiniin sitoutuvien avidiinimutanttien rikastumista ei kuitenkaan havaittu, mikä saattaa johtua faagien epäspesifisestä sitoutumisesta ja erilaisia avidiinimutantteja esittelevien faagien erilaisista tuottotasoista bakteerisoluissa. Tästä huolimatta tässä työssä esitetyt menetelmät ja tulokset antavat vankan pohjan avidiinimutanttien faagiseulonnassa käytettyjen menetelmien kehittämiselle.
Asiasanat:Faagiseulonta, avidiini, AVR2, BBP-A, D-biotiini, DNA:n sekoitus