Pentraxin -Carbonic anhydrase CA VI: A novel multidomain protein

Abstract

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Hiilihappoanhydraasi- proteiinit (carbonic anhydrases, CAs) toimivat kudoksien ja nesteiden pH:n säätelyssä katalysoiden CO2 + H2O HCO3− + H+ reaktiota. Hiilihappoanhydraasit ovat eliölajeille tärkeitä proteiineja, joiden rakenne ja toimintaympäristö vaihtelevat eri isoentsyymeillä. CA VI on erittyvä proteiini, jota on löydetty syljestä ja äidinmaidosta. CA VI – proteiiniin mm. sammakoilla, kaloilla ja kanalla on kiinnittynyt pentraksiinidomeeni, jonka tarkkaa merkitystä ei vielä tiedetä. Työn tavoitteena on tutkia hiilihappoanhydraasi VI -entsyymin esiintyvyyttä eri lajeilla, rakennetta ja rakenteen konservoituneisuutta eri lajien kesken bioinformatiikan menetelmin. Tavoitteena on valmistaa konstrukti proteiinin tuottamista varten bakteeri- ja hyönteissoluissa käyttäen molekyylibiologian menetelmiä, sekä tutkia miten CA6 geenin hiljentäminen vaikuttaa alkuvaiheen kehityksessä seeprakalojen fenotyyppiin.Tutkimusmenetelmät: Tietokannoista löytyvien CA VI proteiinisekvenssien tarkastelu toteutettiin bioinformatiikan menetelmillä. Molekyylibiologisia menetelmiä käyttäen valmistettiin konstrukti seeprakalan CA VI proteiinin tuottoa varten. Seeprakalojen fenotyyppejä vertailtiin alkioiden kehityksen vaiheiden tutkimuksessa histologian menetelmin. Tutkimustulokset: Sekvenssien rinnastus ja rakenteen analyysit osoittivat kohtia, joissa oli useampia konservoituneita aminohappoja. Yksi konservoituneista alueista sisälsi monille lajeille yhteisen glykosylaatiokohdan. Proteiinin 3D rakenteella tarkasteltuna havaittiin proteiinin aktiivisen kohdan voimakas konservoituminen eri lajien kesken. Proteiinin tuottoa varten valmistettiin konstrukti, jonka sisältämän seeprakalan CA VI -proteiinin nukleotidisekvenssi varmistettiin. Seeprakalojen CA6 geenin hiljentämisen jälkeen alkioiden ja kehittyvien poikasten näytteissä ilmeni morfologisia muutoksia uimarakkulassa ja vatsan alueella.Johtopäätökset: Analyysit vahvistivat CA VI proteiinin olevan eritetty proteiini, johon on liittynyt signaalipeptidi. Konservoituneiden aminohappojen joukosta löytyi alue, jossa useimmista sekvensseistä löytyy kohta glykosylaatiolle. Rakenteen 3D malli osoitti hyvin sekvenssien konservoituneet alueet. Muutamilla lajeilla CA VI proteiiniin liittyneen pentraksiinin toimintaa ei vielä tunneta. Proteiinin tuottoa varten tehtiin konstrukti, jonka CA VI proteiinia koodaava sekvenssi todettiin bioinformatiikan menetelmällä oikeaksi. Seeprakaloilla CA6 geenin hiljentäminen aiheutti epämuodostumia uimarakon ja vatsan alueella. ABSTRACTBackground and aims: Carbonic anhydrases (CAs) participate in the maintenance of pH homeostasis catalyzing the reversible hydration of carbon dioxide CO2 + H2O HCO3− + H+. CAs is fundamental to a wide array of physiological processes in species and driving the diversification of CA isoforms in different environments. The CA VI is a secreted protein, found in saliva and breast milk. In some species, such as frogs, fish and chicken a part called pentraxin is attached to CA VI – protein. A function of this pentraxin is not known. In the present study, we investigated the characteristics of CA VI in different species. The alignment of sequences, the structure of protein and conservation among different species were observed using bioinformatics methods. The other focus on this study was to build a construct for zebrafish CA VI protein production in bacterial and insect cells and to observe the knockdown zebrafish embryonic development in early states using molecular biology and histological methods.Methods: The CA VI protein sequences found in the databases aligned and studied with bioinformatics methods. The molecular biology methods used to build the construct for the protein production of zebrafish CA VI and to study the knockdown effect in zebrafish embryos. Results: The alignment and the analysis of CA VI structure showed the regions of conserved amino acids in different species. One of these regions included the N-glycosylation site found in most of the studied sequences. The study of the 3D structure showed strong conservation at the active site of the protein. The construct has built for the zebrafish CA VI protein production. The template sequence of the construct verified with sequencing. The samples from the CA6 knockdown zebrafish embryos and fry showed changes in morphology of the swim bladder and the stomach area.Conclusions: The analysis confirms that the CA VI is a secreted protein having a signal peptide, and the N-glycosylation site predictions gave novel information about the conserved N-glycosylation site found in different species sequences. The visualizing tool proved to be very helpful of showing the conserved regions in 3D structure. The function of the attached pentraxin part remains unknown. A construct for zebrafish CA VI protein production was produced. The sequencing results verified with bioinformatics methods that the template codes the correct CA VI protein. The morphology results showed the malformation of the swim bladder and stomach area of the CA6 knockdown zebrafish.