Influence of pluripotent stem cell culture conditions on cardiac differentiation
MIETTINEN, MARINKA (2012)
2012
Biokemia - Biochemistry
Biolääketieteellisen teknologian yksikkö - Institute of Biomedical Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2012-01-16
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-22089
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-22089
Tiivistelmä
Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Soluviljelyssä tavoitteena on pitää kantasolut erilaistumattomina. Kantasolujen tulisi kasvaa yhtenäisen näköisinä ja pyöreä-reunaisina kolonioina ja niiden spontaani erilaistuminen tulisi estää. Kantasolujen viljelyssä yleensä käytettävä tukisolukko erittää tärkeitä tekijöitä, jotka aikaansaavat kantasolujen jakautumisen ja lisääntymisen ja estävät erilaistumista. Tässä tutkimuksessa käytettiin kolmea erilaista kasvatusmenetelmää: 1) hiiren embryonaaliset fibroblasti-solut (MEF) tukisolukkona KSR soluviljelynesteessä, 2) SNL-tukisolukko, joka on klonaalisesti STO-solulinjasta erilaistettu ja joka ilmentää sekä G418 resistenssiä että leukemia inhibitorista tekijää (LIF) KSR soluviljelynesteessä ja 3) Matrigel alusta, joka on gelatiinia sisältävä Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) hiiren sarkooma solujen erittämä proteiini-sekoitus. Matrigel alustan kanssa soluviljelynesteenä käytettiin kaupallista mTeSR1:tä. Kantasolulinjoja viljeltiin näissä eri olosuhteissa kunnes ne erilaistettiin sydänlihassoluiksi. Sydänlihassolu-erilaistus suoritettiin kaikille olosuhteille ja linjoille kolme kertaa. Tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida pluripotenttien kantasolujen; ihmisen alkion kantasolujen (hESC-solut) ja indusoitujen kantasolujen (iPS-solut), erilaistumista sydänlihassoluiksi. Lopuksi erilaistettujen sydänlihassolujen ominaisuuksia tutkittiin eri tavoin.
Tutkimusmenetelmät: Sydänlihassoluksi erilaistamisen tehokkuutta arvioitiin troponiini T-positiivisia sydänlihassoluja laskemalla käyttäen cytospin-menetelmää. Lisäksi laskettiin kasvatusalustalta sykkivät alueet, arvioitiin niiden kokoa ja morfologiaa. Erilaistamattomia ja erilaistettuja soluja värjättiin immunosytokemiallisin menetelmin. Tyypillisten kantasoluissa sekä sydänlihassoluissa esiintyvien geenien ilmentymistä määritettiin päivinä 0, 3, 6, 13 ja 30 sydänlihassolu-erilaistamisen aikana käyttämällä kvantitatiivista PCR-analyysiä (qPCR).
Tutkimustulokset: Käytettyjen solulinjojen erilaistumisaste oli matala. Kaupallinen H7-solulinja erilaistui tehokkaammin kuin solulinjat UTA.00112.hFF ja UTA.04602.WT. qPCR-analyysissä ilmentyi kantasolu-geenejä. Sydänlihassolu-markkerien ilmentymistä oli kaikilla solulinjoilla kaikista olosuhteista vaihtelevissa määrin.
Johtopäätökset: MEF-solujen päällä viljellyt pluripotentit kantasolut erilaistuivat parhaiten sydänlihassoluiksi. Matrigeelillä viljellyt plutipotentit kantasolut taas muodostivat vähemmän sykkiviä sydänlihassoluja. Tutkimuksesta saatavaa tietoa kasvatusolosuhteiden vaikutuksesta sydänlihassolujen erilaistamiseen voidaan käyttää jatkotutkimuksissa parantamaan sydänlihassolujen erilaistamisen tehokkuutta.
Asiasanat:pluripotent stem cell, cardiac differentiation, culture condition
Tutkimusmenetelmät: Sydänlihassoluksi erilaistamisen tehokkuutta arvioitiin troponiini T-positiivisia sydänlihassoluja laskemalla käyttäen cytospin-menetelmää. Lisäksi laskettiin kasvatusalustalta sykkivät alueet, arvioitiin niiden kokoa ja morfologiaa. Erilaistamattomia ja erilaistettuja soluja värjättiin immunosytokemiallisin menetelmin. Tyypillisten kantasoluissa sekä sydänlihassoluissa esiintyvien geenien ilmentymistä määritettiin päivinä 0, 3, 6, 13 ja 30 sydänlihassolu-erilaistamisen aikana käyttämällä kvantitatiivista PCR-analyysiä (qPCR).
Tutkimustulokset: Käytettyjen solulinjojen erilaistumisaste oli matala. Kaupallinen H7-solulinja erilaistui tehokkaammin kuin solulinjat UTA.00112.hFF ja UTA.04602.WT. qPCR-analyysissä ilmentyi kantasolu-geenejä. Sydänlihassolu-markkerien ilmentymistä oli kaikilla solulinjoilla kaikista olosuhteista vaihtelevissa määrin.
Johtopäätökset: MEF-solujen päällä viljellyt pluripotentit kantasolut erilaistuivat parhaiten sydänlihassoluiksi. Matrigeelillä viljellyt plutipotentit kantasolut taas muodostivat vähemmän sykkiviä sydänlihassoluja. Tutkimuksesta saatavaa tietoa kasvatusolosuhteiden vaikutuksesta sydänlihassolujen erilaistamiseen voidaan käyttää jatkotutkimuksissa parantamaan sydänlihassolujen erilaistamisen tehokkuutta.
Asiasanat:pluripotent stem cell, cardiac differentiation, culture condition