Construction of chimeric AVR2/4 library by means of DNA shuffling and Gateway cloning.
OJALA, ELINA (2011)
2011
Biokemia - Biochemistry
Lääketieteellinen tiedekunta - Faculty of Medicine
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2011-01-20
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-21140
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-21140
Tiivistelmä
Tutkielman tausta ja tavoitteet: Riittävän suuren ja hyvälaatuisen yhdistelmäkirjaston kokoaminen on yksi faagiseulonnan (engl. phage display) suurimpia haasteita. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää uusia työkaluja ja menetelmiä kimeeristen avidiinikirjastojen kokoamiseen. Yhdistämällä DNA:n sekoitus (engl. DNA shuffling) ja Gateway-kloonaustekniikat haluttiin saada aikaan entistä tehokkaampi kirjastojenkokoamisstrategia. Gateway-menetelmää testattiin ja hyödynnettiin DNA:n sekoituksella kootun kimeerisen avidiini-kirjaston kloonauksessa.
Materiaalit ja menetelmät: Gateway-kloonaukseen sopiva phagemid-vektori (pGWphagemid) koottiin kloonaamalla ccdB-itsemurhageeni ja attR-rekombinaatiosekvenssit tavalliseen phagemid-vektoriin. Homologiset, avidiinin kaltaiset AVR2 ja AVR4 cDNA:t toimivat lähtömateriaalina kimeerisen AVR2/4-kirjaston luomisessa. DNA:n sekoituksen PCR-tuotteet siirrettiin pGWphagemid-vektoriin LRkloonausreaktiolla ja kirjastoa ilmennettiin E. colissa. AVR2/4-variantteja tutkittiin sekvensoimalla 96 kloonia ja mittaamalla niiden biotiininsitomiskykyä ELISA:lla.
Tulokset: Kimeerisen AVR2/4 DNA-kirjaston LR-kloonaus pGWphagemid-vektoriin tuotti kooltaan keskikokoisen, 106 kloonia sisältävän kirjaston. Kirjasto on laadultaan ja diversiteetiltään korkeatasoinen, sillä kaikki sekvensoidut geenit olivat kokonaisia ja kimeerisiä. Sekvensseistä 76 % oli uniikkeja proteiinitasolla ja crossovereita havaittiin keskimäärin 2,26(±0,07). Duplikaatioita tai deleetioita ei havaittu ja aminohappomutaatioitakin vain erittäin vähän (0,011 %). Toiminnallisuus oli myös säilynyt erittäin hyvin, sillä ELISA:ssa havaittiin 26 biotiinia sitovaa kloonia.
Johtopäätökset: Kimeerisen AVR2/4-kirjaston kokoaminen onnistui ja DNA:n sekoituksen ja Gateway-kloonauksen yhdistelmä vaikuttaa käyttökelpoiselta faagikirjastojen kokoamisstrategialta. Koottua pGWphagemidia käytettiin onnistuneesti kohdevektorina LR-kloonauksessa ja sitä voidaan hyödyntää muidenkin kirjastojen kokoamisessa. AVR2:n ja AVR4:n DNA:n sekoitus onnistui hyvin, ja vastaaviakimeerisiä faagikirjastoja aiotaan hyödyntää steroideja sitovien avidiinien ominaisuuksien parantamisessa.
Avainsanat: DNA:n sekoitus, Gateway-kloonaus, faagikirjasto, avidiinin kaltaiset geenit
Materiaalit ja menetelmät: Gateway-kloonaukseen sopiva phagemid-vektori (pGWphagemid) koottiin kloonaamalla ccdB-itsemurhageeni ja attR-rekombinaatiosekvenssit tavalliseen phagemid-vektoriin. Homologiset, avidiinin kaltaiset AVR2 ja AVR4 cDNA:t toimivat lähtömateriaalina kimeerisen AVR2/4-kirjaston luomisessa. DNA:n sekoituksen PCR-tuotteet siirrettiin pGWphagemid-vektoriin LRkloonausreaktiolla ja kirjastoa ilmennettiin E. colissa. AVR2/4-variantteja tutkittiin sekvensoimalla 96 kloonia ja mittaamalla niiden biotiininsitomiskykyä ELISA:lla.
Tulokset: Kimeerisen AVR2/4 DNA-kirjaston LR-kloonaus pGWphagemid-vektoriin tuotti kooltaan keskikokoisen, 106 kloonia sisältävän kirjaston. Kirjasto on laadultaan ja diversiteetiltään korkeatasoinen, sillä kaikki sekvensoidut geenit olivat kokonaisia ja kimeerisiä. Sekvensseistä 76 % oli uniikkeja proteiinitasolla ja crossovereita havaittiin keskimäärin 2,26(±0,07). Duplikaatioita tai deleetioita ei havaittu ja aminohappomutaatioitakin vain erittäin vähän (0,011 %). Toiminnallisuus oli myös säilynyt erittäin hyvin, sillä ELISA:ssa havaittiin 26 biotiinia sitovaa kloonia.
Johtopäätökset: Kimeerisen AVR2/4-kirjaston kokoaminen onnistui ja DNA:n sekoituksen ja Gateway-kloonauksen yhdistelmä vaikuttaa käyttökelpoiselta faagikirjastojen kokoamisstrategialta. Koottua pGWphagemidia käytettiin onnistuneesti kohdevektorina LR-kloonauksessa ja sitä voidaan hyödyntää muidenkin kirjastojen kokoamisessa. AVR2:n ja AVR4:n DNA:n sekoitus onnistui hyvin, ja vastaaviakimeerisiä faagikirjastoja aiotaan hyödyntää steroideja sitovien avidiinien ominaisuuksien parantamisessa.
Avainsanat: DNA:n sekoitus, Gateway-kloonaus, faagikirjasto, avidiinin kaltaiset geenit