b1,3-Glukosyylitransferaasin tuoton optimointi ja puhdistus

Abstract

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Tutkimuksen tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa b1,3-glukosyylitransferaasia (b3Glc-T), jonka geeni oli alun perin löytynyt ohutsuolen epiteelisolujen erilaistumista mallintavasta soluviljelmäjärjestelmästä. Tutkimuksessa pyrittiin optimoimaan tuotto-olosuhteita ja puhdistusjärjestelmää puhtaan b3Glc-T:n mahdollisimman suuren saannon saavuttamiseksi käytettävissä olevilla resursseilla. Tuotettavaa proteiinia tarvittiin tämän ominaisuuksien kuten entsymaattisen aktiivisuuden ja rakenteen selvitykseen sekä proteiinin tunnistavien vasta-aineiden testaukseen. Täysimittaisen b3Glc-T:n lisäksi tavoitteena oli tuottaa myös lyhempää, todennäköisesti helpommin kiteytyvää aminoterminaaliseksi domeeniksi kutsuttua aluetta. Tämän rakenteen teki mielenkiintoiseksi sen mahdollinen osallistuminen b3Glc-T:n oligomerisoitumiseen, substraattien tunnistukseen tai oikean toimintaympäristön tunnistukseen.

Tutkimusmenetelmät: b3Glc-T:a tuotettiin yhdistelmäproteiinina bakulovirus-hyönteissolu-tuottojärjestelmässä. b3Glc-T:n aminoterminaalista domeenia tuottavat bakuloviruskannat valmistettiin E. coli -bakteereissa paikkakohtaiseen transpositioon perustuvalla menetelmällä. Tuotetut proteiinit puhdistettiin affiniteettikromatografisesti niihin liitetyn avidiini- tai histidiini-puhdistuskahvan avulla. Tuotetun proteiinin määrää ja puhdistuksen tehokkuutta arvioitiin immunoblottauksen ja Coomassie- sekä hopeavärjäysten perusteella.

Tutkimustulokset ja niiden tarkastelu: b3Glc-T:n tuottotasoja saatiin parannettua bakulovirus-hyönteissolu-tuottojärjestelmään liittyvien muuttujien arvojen optimoinnilla. Adherenttiviljelmät tuottivat b3Glc-T:a elatusliuokseen noin 250 ng/ml:ssa, mutta suurin osa tuotetusta proteiinista jäi eritysreitille ohjauksesta huolimatta solun sisälle. Suspensioviljelmillä saatiin runsas tuotto, mutta b3Glc-T:a tuottavan virusvaraston tiitterin laskun ja puhdistusvaiheessa esiintyneiden ongelmien vuoksi kiteytykseen tarvittavaa määrää riittävän puhdasta b3Glc-T:a ei onnistuttu tuottamaan. Kaksi uutta bakuloviruskantaa valmistettiin paikkakohtaiseen transpositioon perustuvalla bakulovirusten valmistusjärjestelmällä. Molempien kantojen avulla saatiin hyönteissoluissa käynnistymään histidiini- tai avidiini-puhdistuskahvaan liitetyn b3Glc-T:n aminoterminaalisen domeenin tuotto. Avidiini-puhdistuskahvaan sidottua proteiinia tuottavalla viruskannalla saatiin runsaita tuottoja, mutta puhdistuksessa käytetyn virheellisen liuoserän vuoksi puhdistetun proteiinin saanto jäi vaatimattomaksi. Puhdistusmenetelmistä His-puhdistuskahvaan perustuvalla puhdistuksella arvioitiin saavutetun noin 70 %:n puhtausasteen. Alustavien tulosten perusteella tätä tehokkaammalta vaikutti Avd-puhdistuskahvaan perustuva puhdistusmenetelmä.

Johtopäätökset: Bakulovirus-hyönteissolu-tuottojärjestelmä soveltuu hyvin sekä täysimittaisen b3Glc-T:n että b3Glc-T:n aminoterminaalisen domeenin tuottoon. Tuottojen puhdistukseen valitut menetelmät vaikuttivat myös tarkoitukseen sopivilta, mutta vaativat vielä lisäoptimointia paremman saannon ja rakenteenmääritykselle riittävän puhtaustason saavuttamiseksi.