Contribution of the ARLTS1 Gene to Prostate Cancer Susceptibility

Abstract

Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä teollistuneissa maissa, myös Suomessa, ja se aiheuttaa toiseksi eniten miesten syöpäkuolemia. Vaikka eturauhassyöpä on hyvin yleinen sairaus, sen syntyyn vaikuttavat syyt ja riskitekijät tunnetaan vielä huonosti, ja taudin ennaltaehkäisy ja hoito ovat hankalia. Perinnöllisten tekijöiden lisäksi eturauhassyöpäriskiä lisääviin tekijöihin luetaan korkea ikä ja etninen alkuperä. Uusien tapausten voimakkaaseen kasvuun johtavia tekijöitä ovat PSA-seulonnan lisääntyminen ja väestön ikääntyminen, mutta taustalla vaikuttaa osin myös vielä tuntemattomia tekijöitä, joita ei ole intensiivisestä tutkimuksesta huolimatta pystytty täysin identifioimaan. Suurin kliininen haaste on taudin käyttäytymisen ennustaminen. Eturauhassyövän geneettisen taustan tutkimus on tuottanut monta syöpäriskiin assosioituvaa riskialttiusgeeniä. Usein löydetyt geenimuutokset edustavat kuitenkin niin sanottuja matalan penetranssin muutoksia, jotka selittävät vain osan perinnöllisestä syöpäriskistä. Yhtenä selityksenä pidetään yksittäisten muutosten yhteisvaikutusta. Mittavista tutkimuksista huolimatta, ei yhtä ainoaa, suuren riskin aiheuttavaa perinnöllisen eturauhasmuodon selittävää alttiusgeeniä ole pystytty löytämään, vaikka useiden kromosomaalisten alueiden on osoitettu kytkeytyvän eturauhassyöpään.

Syövänestogeeninä ja solukuoleman säätelyssä toimivan ADP-ribosylation factor like tumour suppressor 1 (ARLTS1) -geenin on osoitettu altistavan erilaisille syöville, erityisesti syövän perinnölliselle muodolle. Tämän väitöskirjatutkimuksen keskeisenä tavoitteena oli selvittää ARLTS1-geenin muutoksia ja molekulaarisia mekanismeja eturauhassyövän kehittymisen ja syöpäalttiuden taustalla suomalaisessa väestössä. ARLTS1-geeni sijaitsee kromosomaalisella alueella 13q14, jossa on todettu häviämiä eturauhassyövässä. ARLTS1-geenin koodaavan alueen geenimuutokset kartoitettiin suomalaisessa eturauhassyöpäaineistossa, eturauhasen kasvainnäytteissä, solulinjoissa ja ksenograftinäytteissä. Myös kolorektaalisyövän ja rintasyövän näytteitä analysoitiin. Tulostemme mukaan ARLTS1 muutos G446A (Trp149Stop) ei altista rinta-, kolorektaali- eikä eturauhassyövälle, mutta G194T (Gly65Val) muutos tilastollisesti merkitsevästi lisää eturauhassyöpäriskiä perheissä ja T442C (Cys148Arg) variantti vaikuttaa sekä rinta- että eturauhassyöpäriskiin suomalaisessa väestössä. Tutkimalla lisää eturauhassyöpäpotilaiden näytteitä, havaitsimme, että ARLTS1 T442C variantin homotsygoottimuutos CC lisää merkitsevästi eturauhasen syöpäriskiä. Variantin kantajilla oli lisäksi taudin aggressiivinen muoto, ja muutos oli yleisin tai jopa ainoa ARLTS1 muutos tutkituissa näytteissä.

ARLTS1-geenin todettiin ali-ilmentyvän syöpäkudosnäytteissä, mikä vahvistaa geenin toimivan kasvunrajoitegeeninä. Bioinformatiiviset analyysit paljastivat ARLTS1:n ilmentymisen olevan vahvasti yhteydessä immuunijärjestelmän prosesseihin. Tätä immuunijärjestelmän ja mahdollisen tulehduksen osuutta eturauhassyövän synnyssä ja ARLTS1-geenin toiminnassa tutkittiin syvemmin hyödyntämällä eturauhassyöpäperheiden SNP-genotyyppaus- ja RNA:n sekvensointimateriaaleja. Tutkimalla eturauhassyöpäperhenäytteiden kokoverestä eristettyä RNA:ta, ARLTS1:n ali-ilmentyminen havaittiin jo ituradan tasolla, ja lähialueen geenimuutosten todettiin vaikuttavan ARLTS1-geenin ilmentymisen tasoon.

Tämä väitöskirjatutkimus antaa arvokasta uutta tietoa eturauhassyövän molekyylitason ilmiöistä. Tulevaisuudessa, lisätutkimusten jälkeen, voimme tutkia löydettyjä, taudille altistavia geenivirheitä kantavien henkilöiden sairastumisalttiutta, paitsi keräämässämme perhemateriaalissa, myös väestötasolla, ja mahdollisesti kehittää geenitestin perityn alttiuden diagnosoimiseksi.

Prostate cancer is the most common malignancy among men in industrialised countries, including Finland. It is a heterogeneous disease with definitive risk factors that include age, ethnic origin and family history. In Finland, the incidence of prostate cancer is 89.4/100,000 and in 2010, 4,697 new prostate cancer cases were diagnosed (http://www.cancer.fi/syoparekisteri/en/). Despite extensive research over the last decade, the aetiological risk factors and genes underlying the genetic susceptibility to prostate cancer remain largely unclear, which has hampered effective prevention and the development of better treatments.

Mutations to known high-penetrance cancer predisposition genes can only explain a small fraction of cancer cases, and therefore, a polygenic model has been proposed in which several low-penetrance alleles may have a multiplicative and/or modifying effect that accounts for a substantial proportion of the familial aggregation of cancer. One such candidate gene is ARLTS1 (ADP-ribosylation factor like tumour suppressor 1, also known as ARL11, ADP-ribosylation factor-like 11), a tumour suppressor gene that is known to function in many human cancers and to play a role in apoptotic signalling. Interestingly, the chromosomal area 13q14, where ARLTS1 resides, was identified in a multi-centre genome-wide linkage search for new prostate cancer susceptibility genes in families with at least five affected members. In addition, the 13q14 locus is among the most frequently deleted chromosomal regions in prostate cancer and hereditary prostate cancer, suggesting that ARLTS1 could be a target for both germline and somatic mutations.

The aim of this thesis study was to provide important new knowledge on the genetics and function of the tumour suppressor gene, ARLTS1, in prostate cancer, and to determine the molecular mechanisms involved in prostate cancer development and susceptibility, especially in patients with a family history of prostate cancer. The outcome of this study can be used to establish a basis for novel strategies for the diagnostics, prevention, prognosis and screening of prostate cancer, including possible novel therapeutic strategies.

We performed direct sequencing and genotyping analyses on both germline DNA from prostate cancer patients and on clinical tumours, xenograft samples and prostate cancer cell lines. Additionally, colorectal and breast cancer samples were analysed. The whole coding region of ARLTS1 was analysed in Finnish familial cancer patients who had at least one affected 1st or 2nd degree relative. The results of this thesis suggest that ARLTS1 polymorphisms, G194T (Gly65Val) and T442C (Cys148Arg), increase the risk of prostate cancer. Further studies of the T442C variant revealed a statistically significant association with an increased risk for homozygous CC carriers both in unselected and familial prostate cancer cases. T442C CC variant carriers had an elevated risk of developing more aggressive disease. Additionally, T442C was the only variant observed with a greater frequency among malignant tissue samples, prostate cancer cell lines and xenografts, supporting its role in prostate carcinogenesis. Interestingly, the T442C variant was the only ARLTS1 variant found in any of the prostate cancer cell lines tested.

Q-RT-PCR revealed that ARLTS1 is widely down-regulated in prostate cancer cell lines, xenografts and tumours. Most of the down-regulated samples also had the CC genotype for the T442C variant. The CC risk genotype was also associated with decreased ARLTS1 expression in immunologically relevant lymphoblastoid cell lines. In addition, the ARLTS1 co-expression signature confirmed the low expression of ARLTS1 in prostate cancer, and ARLTS1 expression was strongly associated with immune system processes. RNA expression analysis of whole-blood derived samples from 84 familial prostate cancer cases and 15 controls showed a significant decrease in ARLTS1 expression levels in prostate cancer cases, indicating an effect of germline alteration on ARLTS1 expression levels. The regulation of ARLTS1 expression was analysed with the expression quantitative trait loci (eQTL) method, and altogether, we identified 14 significant cis-eQTLs located in regulatory regions of the 13q14 locus that affected ARLTS1 expression levels.