Negative regulation of Drosophila immune response

Abstract

Banaanikärpäsen immuunivasteen negatiivinen säätely

Ihmisen immuunipuolustus voidaan jakaa synnynnäiseen ja hankittuun immuniteettiin. Synnynnäistä immuniteettia tarvitaan rajoittamaan infektion leviämistä sen alkuvaiheessa sekä ohjaamaan hankitun immuunivasteen käynnistymistä. Synnynnäisen immuniteetin vasteiden säätelyssä avainasemassa ovat signalointireitit, jotka aktivoituvat solun pinnalla olevien reseptoriproteiinien tunnistettua suoraan mikrobirakenteita tai toisten solujen erittämiä viestimolekyylejä, sytokiinejä. Puutteet synnynnäiseen immuniteettiin liittyvissä signalointiketjuissa altistavat infektioille, toisaalta liian voimakas tai aiheetta aktivoituva immuunireaktio on syynä moniin autoimmuuni- ja tulehdussairauksiin, kuten allergioihin, nivelreumaan ja psoriasikseen.

Banaanikärpänen (Drosophila melanogaster) on jo pitkään ollut runsaasti käytetty mallieläin ja onkin osoittautunut hyödylliseksi muun muassa synnynnäisen immuniteetin tutkimisessa. Kärpäsellä immuunipuolustusta patogeenisiä bakteereita, sieniä ja hiivoja vastaan säätelevät Toll-, Imd- ja JAK/STAT-signalointireitit, jotka muistuttavat läheisesti ihmisen Toll-like Receptor (TLR)-, Tumor Necrosis Factor (TNFR)- ja JAK/STAT-signalointireittejä. Vaikka näiden reittien positiivista säätelyä on tutkittu runsaasti viimeisen kymmenen vuoden aikana, ei negatiivisesta säätelystä tiedetä vielä paljoakaan.

Väitöstutkimuksessa pyrittiin löytämään uusia banaanikärpäsen immuunipuolustusta negatiivisesti sääteleviä molekyylejä ja mekanismeja. Kullekin signalointireitille tehtiin genominlaajuinen RNA-häirintään (RNAi) perustuva seulonta viljellyissä banaanikärpäsen soluissa, minkä jälkeen löydettyjen geenituotteiden merkitystä kärpäsen immuunipuolustukselle tutkittiin tarkemmin.

Imd-reitin negatiivisessa säätelyssä löydettiin kaksi uutta molekyyliä: tumassa toimiva zfh1-transkriptiotekijä sekä reitin kohdegeeninä aktivoituva Pirk, jonka osoitettiin estävän signaalinvälitystä reitin reseptorikompleksin toimintaa häiritsemällä. Myös banaanikärpäsen JAK/STAT-signaloinnille löydettiin uusi reseptoritason säätelymekanismi: ET on signalointia estävä solukalvoproteiini, joka muistuttaa rakenteeltaan ihmisen IL-6-reseptoria ja JAK/STAT-signalointia säätelevää proteiinia gp130:ta. Myös Toll-signalointireitin negatiiviksi säätelijöiksi löydettiin uusia kandidaatteja.

Tutkimus osoittaa, että banaanikärpäsen immuunipuolustuksen signalointiketjujen säätelyyn osallistuu useita molekyylejä, ja säätelyä tapahtuu monella tasolla, mukaan lukien transkriptiotason säätely, negatiivisten palautejärjestelmien (negative feedback loop) käyttö, sekä reseptorikompleksien toiminnan estäminen. Koska immuunivasteita ohjaavat signalointiketjut ovat säilyneet hyvin evoluutiossa, voidaan banaanikärpäsellä saatuja tuloksia mahdollisesti hyödyntää myös ihmisen immuunijärjestelmän toiminnan ymmärtämiseksi.

The human immune system consists of innate and adaptive immunity. Athough the adaptive immune response can be highly specific against various pathogens, it takes days to get fully operational. Over those days the innate immunity is needed for limiting the infection as well as regulating the initiation of the adaptive response. Innate immune reactions are regulated by signaling cascades, which are activated by receptors that recognize microbial structures and secreted cytokine molecules. Both the Toll-like receptor (TLR) signaling cascade and the tumor necrosis factor (TNFR) signaling cascade lead to activation of the transcription factor NF-κB and expression of its numerous target genes. Another group of important regulators of inflammatory and stress responses are the Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) molecules, which are activated by several cytokines, such as interleukins, and the Janus kinases (JAKs). Deficiencies in the signaling cascades regulating the innate immune responses predispose people to infections, whereas too vigorous or inappropriate immune reactions cause several inflammatory and autoimmune diseases. Because the JAK/STAT signaling cascade is important in the regulation of many other biological processes as well, for example the proliferation and differentiation of blood cells, disturbances in the signaling can also lead to hematopoietic diseases and cancer.

The fruit fly Drosophila melanogaster has long served as an amenable and widely-used model organism in various aspects of biological research, including studying innate immunity. The usefulness of the fruit fly in this branch of research was demonstrated for example by the nomination of the Nobel Prize in Medicine in 2011 to Jules Hoffmann and Bruce Beutler for their findings showing the similarity between the human and Drosophila innate immune systems.

The Toll, Imd and JAK/STAT signaling cascades found in Drosophila closely resemble the TLR, TNFR and JAK/STAT pathways in humans. As the Toll and Imd pathways lead to production of antimicrobial peptides, they play a key role in flies’ resistance against pathogenic bacteria, fungi and yeast, whereas the JAK/STAT pathway regulates stress responses and cell-mediated immunity. Although these pathways have been intensely studied during the last decades, and it has also become clear that they need to be tightly controlled; in Drosophila, the molecules and mechanisms responsible for their negative regulation have remained largely elusive.

The aim of this study was to identify and characterize novel gene products that negatively regulate the Drosophila immune response, as well as assess their possible conservation between flies and man. In order to identify novel gene products, an RNA interference –based screen was conducted for each signaling pathway in cultured Drosophila cells. Thereafter the identified genes were further studied. Two novel regulators were identified for Imd signaling: a nuclear transcription factor zfh1 and pirk, which is a target gene of Imd signaling. Overexpression of pirk silenced Imd pathway response also in vivo, making the flies more susceptible to bacterial infection. Pirk was shown to interact with the pathway receptor PGRP-LC and the closest downstream component imd, which suggests it might act by disturbing the function of the receptor complex. Zfh1 regulates at least some of the Imd pathway target genes also in vivo, and its human homolog ZEB1 appears to participate in regulation of TNFR signaling in human cells.

A new mechanism for JAK/STAT pathway regulation was also discovered. ET is a cell membrane protein, which resembles the Drosophila JAK/STAT pathway receptor Dome as well as the human IL-6 receptor and its associated protein gp130. ET was shown to negatively regulate JAK/STAT signaling both in vitro and in vivo using ET RNAi flies and several in vivo assays. In addition, ET interacts with the receptor Dome and the kinase hop, and thereby regulates the phosphorylation and activation of the transcription factor Stat92E. New candidates for negative regulators of Drosophila Toll pathway were also identified.

This study shows that the signaling cascades mediating Drosophila immune response are regulated by several molecules and at multiple levels, using mechanisms such as transcriptional regulation, negative feed-back loops and inhibition of receptor complexes.