Fibroblast feeder cells in human pluripotent stem cell culture and retinal differentiation - progress toward clinical cell therapy

Abstract

Ihmisen alkion kantasoluista (hESC) ja geneettisesti pluripotenttiin tilaan uudelleen ohjelmoiduista indusoiduista kantasoluista (hiPSC) voidaan tuottaa rajattomasti erilaisia solutyyppejä kliinisiin kantasoluhoitoihin. Yksi lupaavimmista käyttökohteista on sokeutumiseen johtavien verkkokalvon rappeumasairauksien hoito. HESC soluista erilaistettuja verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluja (RPE) testataankin parhaillaan silmänpohjan ikärappeuman hoitoon ensimmäisissä kliinisissä kokeissa. Tällä hetkellä yleisesti käytössä olevat kantasolujen laboratorioviljelyolosuhteet sisältävät tuntemattomia ja eläinperäisiä ainesosia, jotka altistavat kantasolut eläinpatogeeneille ja immunogeenisille eläinperäisille molekyyleille. Kliiniseen käyttöön tarkoitetut kantasolut tulisi eristää, viljellä ja erilaistaa Good Manufacturing Practise (GMP)-laatustandardiston mukaisesti, ilman eläinperäisiä materiaaleja. Myös kantasolujen erilaistumista verkkokalvon soluiksi ohjaavat tekijät tunnetaan heikosti ja tehokkaampien erilaistusmenetelmien kehittäminen on tärkeää.

Tässä väitöskirjatyössä testattiin ja optimoitiin eläinperäisiä ainesosia sisältämättömiä ja GMP-soveltuvia erilaistumattomien kantasolujen viljelyliuoksia, tukisoluja ja tukisoluttomia viljelymenetelmiä. Lisäksi tutkittiin tukisolujen merkitystä erilaistumattomien kantasolujen viljelyssä ja erilaistamisessa RPE-soluiksi. Tutkimuksen tuloksena perustettiin eläinkomponentittomia tukisolulinjoja ja tukisoluille optimoitiin kliiniseen käyttöön soveltuvat viljelymenetelmät. Näitä prosesseja voidaan tulevaisuudessa käyttää myös kliiniseen käyttöön tarkoitettujen hiPSC-solujen tuottamiseen ihon sidekudossoluista. Kantasoluja tukevien ja tukemattomien tukisolujen todettiin eroavan soluväliaineen proteiinien, etenkin laminiinien, ja niiden integriinireseptorien tuotossa. Laminiini-511 tunnistettiin kantasolujen kasvua ylläpitäväksi tukisolujen erittämäksi laminiiniksi. Tutkimuksen tuloksena identifioitiin myös uusia mahdollisia kantasolujen kasvua ylläpitäviä tukisolujen tuottamia tekijöitä. Tukisolujen erittämien tekijöiden todettiin myös edistävän kantasolujen erilaistumista RPE-soluiksi, minkä todettiin osittain johtuvan aktiviini A -kasvutekijän erityksestä. Lisäämällä aktiviini A -kasvutekijää viljelyliuokseen, saatiin erilaistumista merkittävästi tehostettua. Tämän tutkimuksen tulokset ovat osaltaan myötävaikuttaneet kantasolujen kliiniseen käyttöön soveltuvien viljelymenetelmien kehittämiseen ja laajentaneet näkemystä kantasolujen erilaistumattomuuden säätelystä ja erilaistumisesta RPE-soluiksi.

The establishment of human pluripotent stem cells (hPSCs) has raised great excitement for their prospective use in the field of regenerative medicine. Human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) can self-renew indefinitely and generate virtually any differentiated cell type, thus serving as an unlimited cell source for cell replacement therapies. One promising clinical application of hPSC-based cell therapies is the treatment of retinal degenerative diseases such as age-related macular degeneration (AMD), which is the leading cause of blindness among the elderly in the western world. Phase one clinical trial on the treatment of AMD with retinal pigment epithelial (RPE) cells differentiated from hESCs was recently commenced.

The standard in vitro culture conditions for undifferentiated hPSCs contain undefined and xenogeneic compounds, exposing the cells to infectious and immunogenic molecules. Although hESCs cultured under such conditions have recently been approved for clinical trials, the use of xenogeneic cell culture material is highly undesirable. Ideally, clinical grade hPSC lines are established using xeno-free culture protocols and according to Good Manufacturing Practice (GMP)-quality requirements. Also, the molecular mechanisms controlling stem cell differentiation to the eye field and further to the RPE fate are poorly understood. Consequently more efficient and defined differentiation protocols are required.

This thesis aimed at testing and optimising xeno-free and GMP-compatible culture protocols for hESCs regarding hESC culture media, feeder-independent culture methods, and feeder cells. Further, the feeder cell contribution to maintenance of pluripotent hESC status and the induction of RPE differentiation were studied.

As a result, human serum (HS) supplemented hESC culture medium was found to suboptimally support xeno-free hESC culture on human feeder cells. Commercial feeder-independent culture methods were found to support long-term hESC culture while feeder-independent and xeno-free methods published by academic research groups were found to be unsupportive. Xeno-free, defined media as well as matrices based on human extracellular matrix (ECM) proteins are today on the market for both feeder-dependent and feeder-independent hPSC culture. Xeno-free human feeder cells were established and clinical grade culture protocols for the feeder cells were optimized. These processes could in the future also serve in the establishment of clinical grade hiPSC lines from dermal tissue. Human dermal fibroblast (hDF) feeder cells were found unsupportive of hESCs while commercial human foreskin fibroblasts (hFF) supported long-term hESC propagation in xeno-free culture system.

The feeder cells were found to differ significantly in their ECM protein, especially laminin, and corresponding integrin receptor expression. Laminin-511 was found to contribute to hESC maintenance in feeder-dependent culture as laminin-511 was secreted only by hESC supportive feeder cells. Other factors with a possible role in the maintenance of pluripotency were identified. Feeder cell conditioned media were found to enhance RPE differentiation of hESCs and hiPSCs. Higher activin A secretion by mouse embryonic fibroblast (mEF) feeder cells was hypothesized to be an inductive agent and a corresponding level of activin A significantly augmented hESC-RPE differentiation. The results of this thesis have contributed to the translation of hPSC research to the clinic by developing suitable culture conditions and provided insights into the mechanisms of maintenance of hESC pluripotency and induction of hPSC-RPE differentiation.