Functional genomics of a three-dimensional epithelial cell culture and coeliac small intestinal mucosal biopsy samples

Abstract

Ohutsuolen pinta muodostuu kryptoissa olevista kantasoluista, jotka erilaistuvat vaeltaessaan kohti villuksen kärkeä. Ohutsuolen villuksen solut elävät vain noin viisi päivää. Solujen lyhyt elinkaari ja jatkuva uusien erilaistuneiden epiteelisolujen tarve asettavat tiukat vaatimukset jakaantumisen, erilaistumisen sekä apoptoosin säätelylle. Solunsisäiset signalointireitit, kuten transformoiva kasvutekijä beta- (TGF?), wingless- sekä reseptori tyrosiini kinaasi-reitti säätelevät solujen jakaantumista ja erilaistumista. Tampereen yliopiston Keliakiaryhmässä kehitetyn kolmiulotteisen soluviljelymallin epiteelisolujen erilaistuminen muistuttaa ohutsuolen krypta-villusakselilla tapahtuvaa solujen erilaistumista. Signalointireittien toimintaa on kartoitettu monin eri tutkimuksin, mutta edelleenkään ei tiedetä tarkasti, kuinka nämä reitit toimivat erilaistuvissa T84 epiteelisoluviljelmässä.

Keliakiassa, geneettisen alttiuden omaavien henkilöiden ohutsuolen limakalvolla vehnän gliadiini, ja vastaavat ohran ja rukiin varastoproteiinit aiheuttavat tulehdusreaktion, jonka vaikutuksesta epiteelisolujen jakautuminen kiihtyy ja erilaistuminen häiriintyy. Vaikka tulehdussolujen tiedetään ottavan osaa keliakiassa ilmenevän suolivaurion syntyyn, silti limakalvovaurion syntymekanismi on epäselvä.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena selvittää minkä geenien ilmentymisessä tapahtuu muutoksia epiteelisolujen erilaistuessa sekä soluviljelmässä, että keliakiaa sairastavan henkilön ohutsuolen epiteelillä. Geenien ilmentymisessä tapahtuvia muutoksia tutkittiin komplementaarisella deoksiribonukleiniinihappo (cDNA) filtterimicroarray-tekniikan avulla, lisäksi muutamien valikoitujen geenien ilmentymistä tutkittiin myös proteiinitasolla. Ilmentymistä tutkittiin kolmiulotteisessa T84 epiteelisoluviljelmässä, jossa solut erilaistettiin joko TGF?:lla tai mesenkyymisolujen erittämillä liukoisilla tekijöillä, ohutsuolen limakalvon biopsioista sekä hoitamattomilta (4 hlöä) ja hoidetuilta (4 hlöä) keliakiaa sairastavilta henkilöltä että terveiltä verrokeilta (4 hlöä), ja sekä yhdistettiin tulokset, jotta saatiin selville mitkä havaituista gluteenin aiheuttamista muutoksista geenien ilmentymisessä ja solujen toiminnassa johtuvat häiriöstä epiteelisolujen erilaistumisessa.

Johtopäätöksinä voidaan sanoa, että kolmiulotteisessa soluviljelmässä TGF? näyttäisi erilaistavan epiteelisoluja tehokkaammin kuin mesenkyymisolujen erittämät liukoiset tekijät. Lisäksi TGF? näyttäisi vaikutavan joko suorasti tai epäsuorasti muihin, kuten wingless- ja reseptori tyrosiini kinaasi-signalointireittien jäsenten ilmentymiseen. Potilasnäytteiden tulokset viittaisivat siihen, että monet keliakiapotilailla ilmentyvät geenit osallistuvat tulehdusreaktion syntyyn sekä vaikuttavat epiteelisolujen erilaistumiseen. Aineistosta löytyi kahdeksan geeniä, joiden ilmentyminen oli samalla tavalla vaikuttunut, kun sekä hoitamattomia että hoidettuja keliakiapotilaita verrattiin terveisiin verrokkeihin, ja yksi geeni, distal-less homeobox 4 (DLX4), jonka ilmentyminen oli merkittävästi koholla kaikissa vertailtavissa ryhmissä. Jotkut näistä geeneistä saattavat olla tärkeitä keliakian patogeneesissä. Kun kahdesta aiemmasta osiosta saadut tulokset yhdistettiin, löytyi 30 samansuuntaisesti muuttunutta geeniä. Gluteenittomalla dieetillä näistä 30:stä geenistä 29:n geenin ilmentyminen palautui. Yhdeksän geeniä näistä 30:stä on suorasti tai epäsuorasti reseptori tyrosiinikinaasin (RTK) säätelemällä reitillä. Lisätutkimukset osoittivat, että epidermaalisen kasvutekijäreseptorin, (EGFR), ?-kateniinin ja Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 1 (WAVE1) proteiinin ilmentyminen oli myös proteiinitasolla koholla, kun hoitamattomia keliakiapotilaita verrattiin terveisiin verrokkeihin. Tämän tutkimuksen mukaan gluteeni näyttäisi aiheuttavan muutoksia epiteelisoluissa epidermaalisen kasvutekijän aloittamalla signalointireitillä. Tämä tutkimus osoitti, että kolmiulotteinen soluviljelymalli on toimiva työkalu ohutsuolen krypta-villus-akselilla tapahtuvien muutosten tutkimisessa.

Epithelial cells in the small intestine undergo rapid turnover, and are therefore closely regulated to maintain homeostasis between proliferation, differentiation and apoptosis. The regulation of these processes affects transforming growth factor beta (TGFbeta) and wingless and receptor tyrosine kinase pathways. The T84 three-dimensional epithelial differentiation model, developed in the coeliac disease study group, is has been shown to mimic the epithelial cell differentiation of intestinal crypt-villus axis. The molecular events which synergistically regulate the cellular differentiation and development in T84 epithelial cells await for further studies.

In coeliac disease, the differentiation of the epithelial cells in the small intestinal epithelium is hampered. Though the immunological reaction induced by gluten in genetically susceptible subjects are known to affect the pathogenesis of coeliac disease, the mechanisms responsible for remodelling the small intestinal mucosa, leading to tissue injury, increased epithelial cell proliferation and failure in differentiation, have remained ambiguous.

The major goal in this study was to elucidate the gene expression occurring in the differentiation of cultured intestinal epithelial cells and epithelial cells in coeliac disease patient samples. To accomplish this, the specific aims were 1) to characterise genes whose transcription is affected in the differentiation of epithelial cells in three-dimensional epithelial cell differentiation model, 2) to characterise the changes in gene expression in small intestinal mucosal biopsy samples from coeliac patients and healthy controls 3) to find and characterise common genes whose transcription has been affected both in a small intestinal epithelial cell differentiation model and in the small intestinal epithelium of coeliac disease patients. In this study the gene expression was assessed using a cDNA filter microarray, furthermore the expression of some selected genes was also defined at protein level. The first section revealed that the major change upon differentiation of epithelial cells in the culture was a diminishing expression of most the significantly affected genes. Furthermore, the expression changes were stronger between TGFbeta1-differentiated and undifferentiated cells than between fibroblast soluble factor -differentiated and undifferentiated cells.

The second section revealed that the expression of several inflammatory mediators was increased in the untreated coeliac patient small intestinal mucosal biopsy samples when compared to treated coeliac subjects and healthy controls. There were eight genes which were similarly affected in both untreated and treated coeliac patients compared to healthy controls. In addition, there was one gene, the distal-less homeobox 4 (DLX4), exhibiting increased gene expression in all comparisons.

The combination of the data from two previous sections evinced 30 genes with similar gene expression. Removal of gluten from the diet induced reversed expression of 29 genes, and nine out of these were located directly or indirectly in the receptor tyrosine kinase pathway starting from the epithelial growth factor receptor. Further characterisation by blotting and labelling revealed increased epidermal growth factor receptor (EGFR), beta-catenin and Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 1 (WAVE1) protein expression in the small intestinal mucosal epithelium of untreated coeliac disease patients compared to healthy controls and treated patients.

It can be concluded that in the three-dimensional epithelial cell differentiation model TGFbeta1 appears to be a more potent differentiating agent than the fibroblast secreted soluble factors. TGFbeta1 seems to modulate, either directly or indirectly, the transcription of members on the wingless and receptor tyrosine kinase signalling pathways such as EGFR and beta-catenin. Many of the genes found to be affected in the coeliac disease patient small intestinal mucosal biopsies are directly or indirectly connected to inflammatory reaction or epithelial cell differentiation. The results of the current study suggest that by combining gene expression data from the three-dimensional epithelial cell culture model with small intestinal mucosal biopsies it is possible to focus on the changes originating from epithelial cells. Furthermore, the results suggest that the epidermal growth factor (EGF)-mediated signalling pathway is possibly involved in the epithelial cell differentiation and coeliac disease pathogenesis. These findings indicate that the epithelial cell differentiation model is a useful tool for studying gene expression changes in the crypt-villus axis.