Whole blood self-tissue transglutaminase-based antibody testing in coeliac disease - From an in-house method to commercial rapid test applications

Abstract

Keliakian toteaminen helpottuu. Väitöskirjassa tutkittiin ensimäistä kertaa uudenlaista, helppoa keliakian pikatestausmenetelmää, joka osoittautui luotettavaksi ja mahdollisti keliakiavasta-aineiden määrityksen nopeasti vastaanotto-olosuhteissa. Väitöskirjan tutkimustulokset ovat nopealla aikavälillä hyödynnetty terveydenhuollon käyttöön.

Keliakia on autoimmuunisairaus, jossa ravinnon gluteeni (vehnä, ohra ja ruis) aiheuttaa ohutsuolen limakalvovaurion tietyn perimän omaaville henkilöille. Lisäksi hoitamattomassa keliakiassa syntyy vasta-aineita verenkiertoon kehon omia rakenteita, etenkin kudostransglutaminaasia, sekä ravinnon gluteenia vastaan. Keliakian taudinkuva on laaja vaihdellen vatsavaivoista suoliston ulkopuolisiin ongelmiin esimerkiksi iholla, keskus- ja ääreishermostossa tai maksassa. Etenkin keliakian riskiryhmissä keliakiapotilaiden lähisukulaiset ja ne, joilla on autoimmuunisairauksia keliakia voi olla myös oireeton, vaikka ravinnon gluteeni on tuhonnut ohutsuolen limakalvon nukan. Keliakia on yleinen sairaus, ja se näyttää jatkuvasti lisääntyvän Suomessa (esiintyvyys jopa 2 %). Moninaisen taudinkuvan vuoksi keliakian tunnistaminen on haastavaa, ja suurin osa terveydenhuollon potilaista on tunnistamatta. Keliakiaa tietämättään sairastavilla henkilöillä voi kuitenkin olla oireita tai löydöksiä, ja he voivat altistua hoitamattoman keliakian komplikaatioille, kuten luukadolle. Keliakiadiagnoosi perustuu tähystyksen yhteydessä otetussa ohutsuolikoepalassa todettuun limakalvovaurioon. Herkät sekä erittäin tarkat veren keliakiavasta-ainetestit ovat jo pitkään olleet tärkeitä työkaluja keliakian seulonnassa ja potilaiden valitsemisessa mahasuolikanavan tähystykseen diagnoosin varmistamiseksi. Tähän asti testaus on kuitenkin vaatinut seerumin erottelemista kokoverinäytteestä sekä keskitettyjä erikoislaboratorio-olosuhteita ja asiantuntijuutta, jotta testitulos olisi luotettava. Täten testaus on suhteellisen kallista, ja testitulos on ollut käytettävissä viiveellä hoitopäätöksen tekemisessä.

Tutkimuksessa arvioitiin uutta, innovatiivista keliakiavasta-ainetestauksen pikamenetelmää, jossa kyseisiä, tautia mittaavia vasta-aineita tutkitaan suoraan kokoverestä, esimerkiksi sormenpään verinäytteestä. Tutkimuksessa tätä uutta menetelmää arvioitiin testaamalla neljällä erilaisella, samaan menetelmään pohjautuvalla, keliakiavasta-ainetestillä yhteensä 268 hoitamatonta ja 143 hoidettua keliakiapotilasta sekä 186 verrokkia. Lisäksi 315 keliakiaepäilyksen alaista potilasta ja 263 gluteenittomalla dieetillä ollutta keliakiapotilasta testattiin prospektiivisesti paikan päällä toimisto-olosuhteissa. Tuloksia verrattiin perinteisiin laboratoriossa tehtäviin keliakiavasta-ainetestien tuloksiin sekä ohutsuolikoepalaan.

Tutkimuksen mukaan uusi yksinkertainen testausmenetelmä oli yhtä luotettava (eri testien herkkyys ja tarkkuus tunnistaa hoitamatonta keliakiaa yli 90 %) kuin perinteiset keliakiavasta-ainetestit keliakian paljastamisessa ja keliakiapotilaan hoidon seurannassa. Tärkeä havainto oli, että uusi menetelmä mahdollisti keliakiavasta-aineiden määrittämisen helposti vastaanotto-olosuhteissakin ilman laboratoriovälineitä jopa viidessä minuutissa keliakiapikatestiä käyttämällä. Menetelmä soveltui myös keliakiavasta-ainetestaukseen laboratorio-olosuhteissa käyttäen perinteistä testaustapaa.

Tutkimuksen perusteella voidaan todeta, että uusi kokoveren keliakiavasta-ainetestaus on varteenotettava vaihtoehto perinteisten ja vaivalloisten seerumin keliakiavasta-ainetestien käytölle. Testi on apuna vielä tunnistamattoman keliakian paljastamisessa. Lisäksi keliakiapikatesti mahdollistaa keliakiavasta-ainetestauksen myös kotiolosuhteissa, ja testejä onkin jo saatavilla apteekeista. Positiivisen testituloksen jälkeen on kuitenkin ehdottomasti hakeuduttava lääkärin vastaanotolle, sillä keliakia tulee diagnosoida tähystyksen yhteydessä otettavasta ohutsuolikoepalasta, ja vasta tämän jälkeen hoito, elinikäinen gluteeniton ruokavalio, voidaan aloittaa.

Coeliac disease is an autoimmune disorder in which small-bowel mucosal damage and circulating coeliac autoantibodies against the autoantigen, tissue transglutaminase (tTG), arise as a result of gluten ingestion. Application of serum autoantibody tests, for example immunoglobulin (Ig) A-class endomysial (EMA) and tissue transglutaminase antibody (tTG-ab), has contributed to our knowledge that the condition presents with a variety of symptoms ranging from abdominal complaints to extraintestinal manifestations of variable degree, or the disease can even be totally silent. Additionally, the disease has proved to be nowadays common, affecting approximately 1% of the population worldwide. However, up to 90% of patients remain undiagnosed and may thus have coeliac-related symptoms unawares or be exposed to the late complications of untreated coeliac disease. The coeliac disease diagnosis is based on findings of mucosal villous atrophy with crypt hyperplasia in a small-bowel biopsy sample. Serological coeliac tests are thus needed and widely used as a first-step screening method among coeliac risk groups and subjects evincing symptoms indicative of the disease, in selecting patients to undergo invasive and diagnostic small-bowel biopsy. Nonetheless, conventional EMA and tTG-ab testing requires serum samples, and external coeliac antigen is used in test kits. Additionally, for accurate serum EMA and tTG-ab testing, expert personnel and centralized special laboratory facilities are needed, this rendering testing relatively costly, and test results are available for decision-making only after a time lag.

The aim of the present study was to evaluate a novel whole blood method utilizing the patient s own fresh tTG, self-tTG, found in erythrocytes of the sample, as the coeliac autoantigen for detecting IgA-class coeliac autoantibodies. For this purpose four whole blood self-tTG-based prototypes - a proof-of-concept in house point-of-care test (POCT), commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and two commercial rapid tests with minor differences, rapid test 1 and rapid test 2 - were used. The results obtained were further compared to those from traditional serum indirect immunofluorescence-based EMA and ELISA-based tTG-ab tests and to diagnostic small-intestinal biopsy, respectively.

Utilizing tTG-deficient tTG knockout mice-derived red blood cells and normal mice red blood cells together with coeliac patients sera for point-of-care testing, the whole blood IgA self-tTG method was first shown to detect antibodies specifically targeted to tTG (I). Subsequently, stored samples from altogether 268 untreated and 143 treated coeliac disease patients and 186 non-coeliac disease controls were studied in the laboratory (I-IV). Further, fresh whole blood samples from 315 patients with coeliac disease suspicion (I, IV) and from 263 known coeliac patients on a gluten-free diet were studied prospectively on site in an office setting (I). On stored whole blood samples tested in the laboratory the in house POCT showed 92% sensitivity and 98% specificity for untreated coeliac disease and agreed well with the traditional serum EMA (agreement 92%) and tTG-ab tests (95%) (I, II). In a selected patient series, where the EMA prevalence was low among untreated coeliac disease patients, the in house POCT (sensitivity 82%) worked equally to the serum EMA test (80%), whereas the serum tTG-ab test (88%) was superior (II). The in house POCT was applicable in the follow-up of the treatment, as positive test results weakened in 90% of coeliac patients after a one-year gluten-free diet (II). Importantly, the in house POCT also proved highly reliable in on site detection of IgA-class tTG-ab in the office among patients with coeliac disease suspicion and among coeliac disease patients on the diet. Additionally, the in house POCT was even able to pick out patients with selective IgA deficiency, when total serum IgA detection was used as positive test control (I).

The commercial whole blood IgA self-tTG ELISA showed 91% sensitivity and 98% specificity for untreated coeliac disease when stored whole blood samples were applied (III). The corresponding figures for rapid test 1 were 93% and 94% (III) and for rapid test 2 97% and 93%, respectively (II, IV). When retrospectively studied coeliac disease patients commenced a gluten-free diet, rapid test 2 results converted from positive to negative in 87% of patients after a one-year follow-up (II, IV). Moreover, rapid test 2 was negative in 97% of long-term treated coeliac disease patients (IV). Rapid test 2 was easy to perform in five minutes, as was rapid test 1, and had 100% intra- and interobserver agreement. In prospective IgA-class tTG-ab detection in the office rapid test 2 agreed with the serum EMA and tTG-ab tests carried out in specialized laboratory facilities in 97% of the 150 cases with coeliac disease suspicion (IV). Rapid test 2 was positive in 31% of 150 patients, and all rapid test-positive patients (n=44) who agreed to undergo small-bowel biopsy showed coeliac-type mucosal lesion (positive predictive value 100%).

It was shown here for the first time that the novel and simple whole blood IgA self-tTG method performs comparably to the traditional serum EMA and tTG-ab tests in coeliac disease case finding, and can also be used in coeliac disease dietary follow-up. Additionally, the principle offers a means of picking out IgA-deficient samples. Unlike the serum EMA and tTG-ab tests, self-tTG testing requires no external coeliac autoantigen, as the patient s own endogenous erythrocyte self-tTG, present in a whole blood sample, is utilized in IgA-class tTG-ab detection. The test principle can be applied as the in house POCT, the commercial ELISA or the commercial rapid test kits which give a test result with minimal workload from a fresh or stored finger prick or venous whole blood sample within five minutes. Essentially, using the rapid tests, tTG-ab can also be determined in office facilities without any additional laboratory equipment and the result can be used for immediate decision-making. It is thus established that application of whole blood IgA self-tTG testing serves as an appropriate alternative to usage of the cumbersome and time-consuming serum EMA and tTG-ab tests.