Regulation of STAT1 through Post-translational Modifications

Abstract

Immuunijärjestelmän solujen tuottamat sytokiinit säätelevät hematopoieettisten solujen erilaistumista, kasvua ja aktiivisuutta. Hematopoieettisten sytokiinien vaikutukset välittyvät soluissa pääsääntöisesti spesifisten solureseptorien aktivaation ja sitä seuraavan JAK ja STAT signalointiproteiinien aktivaation kautta. Yleinen mekanismi jolla JAK-STAT proteiinit välittävät signaalin tumaan on riippuvainen reseptoriin liittyneiden JAK proteiinien aktivaatiosta sekä niiden välittämästä STAT transkriptiotekijöiden tyrosiinifosforylaatiosta. Fosforyloituneiden STAT molekyylien muodostama dimeeri kulkeutuu solun tumaan, jossa se sitoutuu kohdegeenien säätelyalueeseen yhdessä muiden proteiinien ns. kofaktoreiden kanssa säätelemään kyseisten geenien ilmentymistä. Interferoni-gamma sytokiinillä on tärkeä rooli immuunivasteissa ja sen säätelemät geeni-ilmentymät välittyvät suurilta osin STAT1 transkriptiotekijän kautta.

Useat eri säätelyproteiinit kuten SOCS, PTP ja PIAS1 ja erityyppiset translaationjälkeiset muokkaukset säätelevät STAT1 proteiinin toimintaa vaikuttaen joko positiivisina tai negatiivisina säätelytekijöinä. PIAS1 proteiini toimii STAT1 transkriptiotekijän negatiivisena säätelijänä, joka todennäköisimmin rajoittaa STAT1 proteiinin sitoutumista kohdegeenin säätelyalueeseen. Useista tutkimuksista huolimatta tarkka mekanismi jolla PIAS proteiinit säätelevät STAT proteiinien aktiivisuutta on jäänyt epäselväksi.

Tässä väitöskirjatutkimuksessa on pyritty selvittämään STAT1 transkriptiotekijän säätelymekanismeja, mm. translaationjälkeisten muokkausten ja PIAS proteiinien toiminnan kautta.

Tulokset osoittivat, että STAT1 proteiini sumoloidaan konservoituneeseen lysiini 703 aminohappotähteeseen ja PIAS proteiinit toimivat E3 ligaaseina SUMO:n konjugaatioreaktiossa. Sumolaation vaikutus STAT1-välitteisen transkription aktivaatioon oli negatiivinen. STAT1:n sumolaation vaikutus STAT1 kohdegeenien aktivaatioon oli selektiivinen ja sumolaatio vähensi geeniaktiivisuutta niillä STAT1:n kohdegeeneillä, joissa STAT1:lla on heikko affiniteetti promoottoriin. DNA:han sitoutuneen STAT1 dimeerin molekulaarinen mallitus ja sen tarkastelu osoittivat, että SUMO konjugaatio voi häiritä STAT1 dimeerin DNA sitoutumista ja siten vähentää transkription aktiivisuutta. Tämä rakennemalli tuki työn kokeellisia löydöksiä, jotka osoittivat, että sumoloimattomalla STAT1 mutantilla oli korkeampi affiniteetti STAT1:n kohdegeenin GBP1 promoottori-elementtiin. Työssä tutkimme myös STAT1:n sumolaation säätelymekanismia ja tuloksemme osoittivat, että STAT1:n seriini 727 fosforylaatio säätelee PIAS1:n sitoutumista joko suoraan tai epäsuorasti SUMO konjugaatiokompleksin muiden proteiinien välityksellä.

Nämä havainnot osoittavat, että sumolaatio on tärkeä STAT1 transkriptiotekijän säätelymekanismi, joka toimii osittain kooperatiivisesti PIAS1 proteiinin kanssa transkription negatiivisena säätelijänä. Tässä tutkimuksessa olemme esittäneet aiemmin karakterisoimattoman JAK-STAT signalointireitin säätelymekanismin, joka toimii sytokiinivasteiden molekulaaristen mekanismien hienosäätelijänä.

Cytokines are produced at multiple sites in the organism and various cytokines act to regulate the development, growth and activation of hematopoietic cells. About 50 members of the hematopoietin family in mammals exert their biological effects through the activation of specific receptors to trigger the janus kinase (JAK)­signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway that represents a rapid membrane to the nucleus signalling system. The JAK-STAT pathway uses a mechanism in which cytosolic latent transcription factors STATs are tyrosine phosphorylated by receptor affiliated JAKs, allowing STAT protein dimerization and localization into the nucleus, where STAT modulates the expression of target genes. Interferon-gamma plays an important function in immune responses against microbes. IFN-gamma-induced gene responses are largely dependent on STAT1. The function of STAT1 is regulated by regulatory proteins such as suppressors of cytokine signalling (SOCS), protein tyrosine-phosphatases (PTP) and protein inhibitors of signal transducer and activator of transcription (PIAS) and by various posttranslational modifications that act in a highly coordinated fashion to combine signals from secreted cytokines and also from microbial agents. SUMO (small ubiquitin-like modifier) modification has emerged as an important transcriptional regulation mechanism of proteins and an increasing number of transcription factors and co-regulators has been reported to be regulated by SUMO modification.

The mechanism by which the PIAS proteins inhibit STAT activity is unclear. Recent findings have demonstrated that all PIAS proteins and Siz proteins in yeast function as SUMO E3 ligases and promote SUMO conjugation to several substrates. These findings prompted us to investigate the possibility that PIASs may have E3 ligase function towards STAT1 and promote its sumoylation. STAT1 was shown to be sumoylated through the E3 ligase function of PIAS proteins. SUMO-1 modification occurs in vivo at a single, evolutionary conserved C-terminal amino acid residue Lys703. Mutation of Lys703 (STAT1-KR) resulted in increased IFN-gamma-mediated transactivation thus suggesting a negative regulatory function of sumoylation in STAT1. More detailed analysis of IFN-gamma target genes indicated that SUMO deficiency of STAT1 selectively modulated the induction of genes showing a similar pattern of gene regulation as observed in PIAS1-/- mice. Molecular modelling of STAT dimer indicated that the SUMO consensus site is well exposed to SUMO-conjugation and SUMO moiety could affect the promoter binding affinity of STAT1. Experimental analysis indicated that SUMO deficient STAT1 displayed higher DNA-binding activity towards guanylate binding protein (GBP) -1 promoter which is well in line with the molecular model. Our results also identified stress induced Ser727 phosphorylation as a regulator of PIAS1 binding and SUMO conjugation to STAT1. These results identify Ser727 phosphorylation promoted sumoylation and PIAS1 binding as a co-operative mechanism for fine-tuning post-translational regulation of STAT1.