Modulation of mitochondrial DNA replication and recombination in mammalian tissues and cultured cells

Abstract

Mitokondriot ovat solujemme energiantuotannosta vastaavia soluelimiä, joilla on oma DNA:sta koostuva perimä eli mtDNA. MtDNA:n sisältämät geenit tuottavat energiantuotannossa välttämättömän soluhengitysketjun proteiineja, tehden tästä keskeisen tekijän myös ihmiskudosten terveelle toiminnalle. Kudokset, kuten hermo- ja sydänlihaskudos, jotka vaativat runsaasti energiaa toimintansa ylläpitämiseen ovat erityisen alttiita mtDNA:n toiminnan häiriöille.

Tutkimuksessani löysin uusia tehtäviä ennestään tunnetuille, mtDNA:n toiminnassa ja ylläpidossa tarvittaville proteiineille. Lisäksi havaitsin, että ihmisellä korkean energiatarpeen omaavat kudokset, kuten sydän, ylläpitävät mtDNA:taan hyvinkin poikkeavalla tavalla. Näissä kudoksissa mtDNA:n monistuminen eli replikaatio on käynnissä samanaikaisesti hyvin aktiivisen rekombinaation kanssa. Näyttäisi myös siltä, että ihmissydämessä replikaatio käynnistetään rekombinaation avulla, kuten monien kasvien ja sienien tapauksessa. On yllättävää, että aktiivinen sydän-mtDNA:n rekombinaatiomekanismi esiintyy ihmisellä muttei hiirellä. Havaitsin kuitenkin, että samankaltainen mekanismi hiiren sydänlihaksen mitokondrioissa voidaan keinotekoisesti aktivoida ilmentämällä joko kohotettua määrää Twinkle- tai TFAM-proteiinia.

Kyseisillä siirtogeeneillä ei ole ulkoisia vaikutuksia hiiriin muuten, kuin että ainakin TFAM siirtogeeni suojaa hiiren sydänlihasta sydänkohtauksen jälkeisiltä muutoksilta ja parantaa näiden selviytymistä huomattavasti. Löydöllä on merkitystä kehitettäessä pitkäaikaista ennustetta parantavia hoitoja vakavan sydäninfarktin saaneille potilaille.

Väitöskirjassani esitetyt löydöt auttavat ymmärtämään korkean energiantarpeen omaavien kudosten mitokondriosairauksien synnyn molekulaarisia mekanismeja, sydänlihasta suojaavia mitokondriotekijöitä sekä TFAM, mTERF että Twinkle proteiinien rooleja mtDNA:n terveen toiminnan turvaamisessa.

Mammalian mitochondrial DNA (mtDNA) is a 16.6 kb circular molecule that encodes parts of the mitochondrial protein synthesis machinery as well as key protein units of the ATP-producing electron transport chain. This feature gives mtDNA a central role in cellular etabolism, and its faithful maintenance is critical for the survival of the organism. Learning to understand how healthy tissues maintain their mitochondrial mtDNA is crucial for understanding the pathological mechanisms of human disorders affecting mtDNA function. In addition to rare mitochondrial disorders, common diseases such as cardiomyopathies and parkinsonism are associated with mtDNA defects.

This work has aimed at increasing our understanding of the similarities and differences of basic molecular mechanisms involved in mammalian mtDNA replication and recombination. To achieve this, I have used a combination of one- and two-dimensional agarose gel electrophoresis and electron microscopy to analyze mtDNA replication intermediates in mammalian cells and tissues in a variety of conditions. In most tissues, mtDNA replicates via a unique strand-symmetric mechanism, which incorporates long stretches of RNA onto the lagging-strand. This RNA is later matured into DNA by a mechanism that is not in relation to the progression of replication fork.

These specific molecular features of mtDNA replication were manipulated by altering the expression of the multifunctional DNA binding protein TFAM as well as by expressing catalytic mutants of the mitochondrial DNA polymerase gamma (PolG) and DNA helicase Twinkle in cultured human cells.

However, high energy tissues such as human heart were found to utilize a completely different means of mtDNA replication. This replication mechanism is associated with highly active molecular recombination and most likely involves recombination-dependent initiation, as seen in the mitochondria of plants and fungi. The abundant mtDNA recombination in heart seems to be a human-specific feature. However, a similar pattern of mtDNA recombination could be induced in tissues of transgenic mice that overexpress Twinkle or human TFAM, indicating that the actual molecular mechanisms of mtDNA recombination are conserved and play a physiologically significant role in mtDNA maintenance in mammalian high energy-demand tissues. The TFAM transgene has also been reported to provide protection from ischemia-induced cardiac remodeling.

Recombination is an efficient means of protection against DNA double-strand breaks, which might occur more readily in the highly oxidative environment of active heart muscle mitochondria. Besides protecting from extrinsic damage, mtDNA needs to be protected from catastrophic errors that might arise from mistakes in replication or transcription. Collisions of transcription and replication machineries can result in double-strand breaks and genome rearrangements. I propose that these can be avoided by tightly regulated passage of the two machineries in mitochondrial replication fork barrier regions (RFBs). As the first RFB-regulating protein from mitochondria a protein called mTERF, which was originally characterized as a mitochondrial transcription termination factor, is reported. These RFBs are also common breakpoints for mtDNA deletion formation. The findings presented in this thesis will help to understand the molecular mechanisms of high energy-demand tissue mtDNA pathologies, myocardial protection from ischemia-induced remodeling and role of RFBs or replication stalling in mtDNA deletion formation.