Characterization of Bone Morphogenetic protein 7 in Breast Cancer

Abstract

Tässä väitöskirjassa tutkittiin luun morfogeneettisen proteiini 7:n (BMP7) aktivaatiota, ilmentymistä, kliinistä merkitystä ja tehtäviä rintasyövässä. Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä länsimaissa ja koskettaa joka kymmenettä naista tämän elinaikana. Luun morfogeneettiset proteiinit (BMP) ovat solunulkoisia signaalimolekyylejä, jotka toimivat hyvin kattavasti selkärankaisten alkiokehityksessä. Ne säätelevät solujen kasvua, erilaistumista ja apoptoosia, sekä voivat nimensä mukaisesti aiheuttaa luun muodostumista. Viime vuosina on saatu enenevästi tietoa siitä, että syövän syntyprosessin aikana erilaiset, normaalin yksilönkehityksen aikana toimivat geenit ja signalointireitit aktivoituvat uudelleen. Luun morfogeneettisten proteiinien keskeinen rooli kehityksen säätelyssä onkin johtanut niiden lisääntyneeseen tutkimukseen myös syövän saralla. Tähänastisten tulosten perusteella BMP-perheenjäsenillä on selvästi merkitystä syövässä, mutta tutkimustuloksia on rajoitetusti ja ne ovat olleet myös osin ristiriitaisia.

Väitöskirjan ensimmäisen ja toisen osatyön tulokset osoittivat, että BMP7 ilmenee suuressa osassa kasvainnäytteistä hyvin voimakkaasti verrattuna normaaliin rintakudokseen, mikä viittaa syövälle spesifiseen ilmentymiseen. BMP7:n lisäksi toinen geeniperheen jäsen BMP4 ilmenee laajasti solulinjoissa ja kasvaimissa. Lisäksi BMP:ille spesifisten reseptorien ilmentyminen osoittaa, että rintasyövässä on toimiva signaalireitti BMP:ille.

BMP7 on selvästi osallinen luustometastaasien muodostumiseen. Kolmannessa osatyössä selvitettiin, miten BMP7:n ilmentyminen liittyy erilaisiin rintasyövän kliinispatologisiin ominaisuuksiin, potilaiden taudin uusiutumiseen ja eliniän ennusteen laajan potilasaineston avulla. Tulosten mukaan BMP7 ilmenee merkittävästi useammin lobulaarista tyyppiä olevissa rintasyövissä kuin duktaalisissa. Yllättävää kyllä, BMP7 ilmeni paikallisuusimissa huomattavasti vähemmän kuin saman potilaan primaarikasvaimessa. Kuitenkin potilaat, joilla oli BMP7 positiivinen primaarikasvain, kärsivät nopeammin kehittyvistä luumetastaaseista. Monimuuttuja-analyysi osoitti, että BMP7 on itsenäinen ennustekijä varhaiselle luumetastaasille. BMP7:n avulla voidaan mahdollisesti tunnistaa potilaita, joilla on lisääntynyt riski saada luustometastaasi.

Viimeisen osatyön tulosten perusteella BMP7 vaikuttaa rintasyöpäsolujen käyttäytymiseen hyvinkin dramaattisesti, mutta solutyyppikohtaisesti. BMP7 mahdollisia vaikutuksia rintasyöpäsolujen ilmiasuun, kuten kasvuun, apoptoosiin ja invasiivisuuteen tutkittiin joko estämällä BMP7 ilmentyminen sitä ilmentävistä rintasyöpäsolulinjoista tai lisäämällä BMP7:ää sitä ilmentämättömiin solulinjoihin. BMP7 lisäsi kasvua kahdella solulinjalla viidestä joko solusyklin tai apoptoosin kautta. Lisäksi BMP7 lisäsi voimakkaasti rintasyöpäsolujen (MDA-MB-231) migraatiota ja invaasiota.

Tässä väitöskirjassa saatujen tulosten perusteella BMP7 ilmenee laajasti rintasyövässä ja vaikuttaa syöpäsolujen ilmiasuun solutyyppikohtaisesti. BMP7 on siten huomioonotettava tekijä rintasyövässä ja lisäksi altistaa erityisesti varhaiselle luustometastaasille. BMP-signaalireitti tarjoaa monia mahdollisuuksia signaalinvälityksen säätelyyn ja on siten myös lupaava kohde kliinisille sovelluksille.

Bone morphogenetic proteins (BMP) are extracellular signaling molecules that regulate vertebrate development and bone formation. Due to their pleiotropic actions, they have been an object of growing interest in cancer research in the last decade. The purpose of this study was to characterize the activation, expression, clinical relevance and function of bone morphogenetic protein 7 (BMP7) in breast cancer.

A previous report indicated that BMP7 may be a putative amplification target gene based on a microarray study conducted on breast cancer cell lines. BMP7 gene copy number and expression were explored in a large panel of 22 breast cancer cell lines, 146 primary breast tumors, and in normal mammary gland tissue. BMP7 copy numbers were analyzed using FISH. BMP7 mRNA and protein expression levels were determined using quantitative RT-PCR and immunohistochemistry. Increased BMP7 copy number was detected in half of the cell lines and in 16% of the primary tumors. Variable BMP7 expression was seen in both cell lines and primary tumors. Although the highest expression levels were detected in specimens with increased copy number, there was no significant association between BMP7 copy number increase and elevated mRNA expression. However, strong BMP7 protein expression was observed in over 70% of primary breast tumors compared to the normal samples indicating cancer specific overexpression.

Systematic expression survey was performed for seven BMP ligands (BMP2-BMP8) and six BMP transmembrane receptors capable of transmitting BMP signals. Expression levels were determined using semiquantitative RT-PCR in 22 breast cancer cell lines and 39 primary breast tumors as well as in normal samples of mammary epithelial cell line and mammary gland tissue. In general the expression patterns in the cell lines were comparable to the patterns obtained from the primary tumors. The expression frequencies and levels differed considerably from one ligand to another and in addition to BMP7, BMP4 had a wide, variable, and cancer-specific expression profile. BMP specific receptors were ubiquitously expressed suggesting that breast cancer can receive BMP signals.

The clinical relevance of BMP7 overexpression in breast cancer was studied in a group of 483 breast cancer patients with complete clinicopathological information and up to 15 years of follow-up. Samples contained 241 lobular carcinomas, 242 ductal carcinomas and 40 corresponding local recurrent tumors. BMP7 protein was expressed in 47% of the primary tumors determined by immunohistochemistry. BMP7 expression was tumor subtype dependent, since it was detected more often in lobular (57%) than in ductal (37%) tumors. Interestingly, BMP7 expression was observed in only 13% of local recurrent tumors. BMP7 expression did not affect overall survival but was clearly and significantly associated with accelerated rate of metastasis formation in bone. A multivariant analysis confirmed that BMP7 was indeed an independent prognostic factor for early bone metastasis.

Finally, the possible contribution of BMP7 overexpression to breast cancer cell line phenotypes was examined using a bidirectional approach. BMP7 expression was silenced using RNA interference in three cell lines (BT-474, MCF7, SK-BR-3) with high endogenous expression and exogenous BMP7 was given to two cell lines (MDA-MB-231, T-47D) with no expression. The consequences of the manipulations were determined using functional assays for proliferation, cell cycle, apoptosis, migration, and invasion. BMP7 influenced the growth of two breast cancer cell lines. BMP7 silencing reduced growth in BT-474 cells that was caused by G1 arrest. Exogenous BMP7 treatment increased MDA-MB-231 growth instead by reducing the number of apoptotic cells. Thus in these two cell lines BMP7 stimulated proliferation either by regulating cell cycle or apoptosis. BMP7 treatment also significantly induced migration and even more drastically invasion of MDA-MB-231 cells. BMP7 does clearly have an impact on breast cancer cell phenotype and this is evidently dependent on the cellular context. Taken together, BMP7 is widely overexpressed in breast cancer and has an impact on breast cancer cell behavior. The clinical data furthermore implies that BMP7 is involved in the bone metastasis process in breast cancer.