Molecular mechanisms of IL-4 induced transcription: Characterization of coregulatory proteins of STAT6

Abstract

Sytokiinit ovat immuunijärjestelmän solujen tuottamia liukoisia välittäjäaineita, jotka säätelevät hematopoeettisten solujen toimintaa. Sytokiinien sitoutuminen spesifisiin reseptoreihinsa kohdesolujen solukalvolla aikaansaa JAK-STAT-signalointireitin aktivoitumisen, ja vaikuttaa useiden geenien ilmentymiseen solussa. Interleukiini-4 (IL-4) on sytokiini, jolla on useita tehtäviä sekä hematopoeettisten solujen kasvun että immunologisen vasteen säätelyssä. IL-4:n vaikutukset solussa välittyvät pääasiassa STAT6-transkriptiotekijän aktivoitumisen kautta. Aktivoitunut STAT6 kulkeutuu tumaan ja sitoutuu kohdegeenien säätelyalueille. Säätelyalueille sitoutuu myös lukuisia muita transkriptiotekijöitä, joiden arvellaan osaltaan vaikuttavan geenien ilmentymiseen eri solu- ja kudostyypeissä. Transkriptiotekijöiden lisäksi geenien ilmentymiseen vaikuttavat myös monet muut säätelyproteiinit, muun muassa erilaiset koregulaattoriproteiinit, jotka voidaan jakaa koaktivaattoreihin ja korepressoreihin. Geenispesifiset ja yleiset transkriptiotekijät, RNA-polymeraasi ja koregulaattorit muodostavat yhdessä transkription aloituskohtaan proteiinikompleksin, jota kutsutaan enhanseosomiksi.

IL-4:n käynnistämän geenivasteen transkriptiotasolla tapahtuvaa säätelyä ei vielä täysin tunneta. Tässä väitöskirjatutkimuksessa onkin pyritty selvittämään STAT6-välitteisen geeniaktivaation mekanismeja tutkimalla transkription aloituskohtaan rakentuvan proteiinikompleksin koostumusta ja eri säätelyproteiinien toimintaa.

Tutkimuksessa identifioimme immunoglobuliini E-geenin (Ige) promoottorialueella STAT6:n sitoutumiskohdan sisällä sijaitsevan uuden sitoutumiskohdan hematopoeettisissa soluissa ilmentyvälle PU.1-transkriptiotekijälle. Tulostemme perusteella PU.1 ja STAT6 toimivat yhteistyössä Ige-geenivasteen käynnistämiseksi, ja PU.1:n ilmentyminen vaikuttaa IL-4-säädeltyjen geenien solutyyppispesifiseen ilmentymiseen. Lisäksi selvitimme koregulaattoriproteiinien toimintaa transkription aloituskompleksissa. Tutkimuksessa tunnistettiin uusi STAT6-välitteisen geeniaktivaation säätelijä, RNA helikaasi A (RHA), joka toimii transkriptionaalisena koaktivaattorina. Aiemmin identifioitu koaktivaattoriproteiini p100 on tulostemme mukaan keskeinen enhanseosomin osa. p100 toimii adaptoriproteiinina useiden kompleksiin kuuluvien proteiinien, esimerkiksi STAT6:n ja CBP:n (CREB binding protein) välillä.

Transkription lisäksi eukaryoottien geenien luentaa voidaan säädellä myös esiaste-RNA:n muokkauksen tasolla. Transkriptiossa syntyvästä esiaste-RNA:sta poistetaan ei-koodaavat intronijaksot silmukoinnissa. Jatkotutkimuksessa havaitsimme, että transkription säätelijänä tunnettu koaktivaattoriproteiini p100 toimii geenisäätelyssä transkription lisäksi myös silmukoinnin tasolla nopeuttaen silmukoinnissa tarvittavan proteiinikompleksin kokoamista.

Väitöskirjatutkimuksessa on selvitetty immuunijärjestelmän toiminnan molekyylitason mekanismeja. Tulokset antavat uutta tietoa IL-4-välitteisen geeniaktivaation käynnistymisestä ja säätelystä.

Signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6) is a main regulator of Interleukin-4 (IL-4)-induced gene responses. The promoter regions of IL-4-inducible genes contain cis-acting elements for several transcription factors that act in concert with STAT6 and are also likely to modulate lineage-specific gene expression. In addition, STAT6 is expected to interact with transcriptional coregulators, which function either by connecting STAT6 to the basal transcription machinery, or by modifying the chromatin structure at the promoters. The ability of STAT6 to activate transcription appears to be strongly dependent on the presence of other transcription factors and coregulators.

The main aim of this thesis project has been to investigate the mechanism of STAT6 mediated transcriptional activation by identifying and characterizing transcriptional coregulators of STAT6. We identified a minimal low-affinity PU.1-core-binding sequence within the STAT6 DNA-binding site in the Ige promoter. Our results suggest that STAT6 and PU.1 co-operate in transactivation of the Ige gene, and the presence of PU.1 in transcription activation complex contributes to the cell type-specific expression of IL-4-responsive genes. We have also identified novel STAT6 transactivation domain (TAD) interacting nuclear proteins. The first of the identified proteins was transcriptional coactivator protein p100 which was found to be an important regulator of STAT6 mediated transcription. In the present study, we identified another novel member of STAT6 enhanceosome, RNA helicase A (RHA). Our results suggest that RHA acts as a coactivator for STAT6 in IL-4 induced STAT6 mediated transcription, and the coactivating function is dependent on the helicase activity of RHA. Previously identified coactivator p100 was found to bridge STAT6 and RHA. To further investigate the mechanism of STAT6 mediated transcriptional activation, we investigated, how STAT6 recruits chromatin modifying activities to the promoter. Coactivator proteins CBP/p300 have been shown to be required for STAT6-mediated gene activation, but the underlying molecular mechanisms are still elusive. Our results suggest that p100 has an important role in the assembly of STAT6 enhanceosome, and that p100 stimulates IL-4-dependent transcription by mediating interaction between STAT6 and CBP and recruiting chromatin modifying activities to STAT6-responsive promoters. These studies demonstrated that p100 has a central role in STAT6 enhanceosome. p100 is composed of four Staphylococcal nuclease (SN)-like domains and a C-terminal TSN domain. The SN-like domains of p100 have been shown to function in transcription, but the function of TSN domain has remained elusive. To analyze the function of TSN domain, we identified by MALDI-TOF TSN domain interacting proteins. p100 TSN was found to interact with small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) that function in pre-mRNA splicing. TSN domain of p100 was also found to enhance the kinetics of the spliceosome assembly. These results suggest that p100 protein functions as a dual function regulator of gene expression that participates via distinct domains in both transcription and splicing processes.