Characterization and functional studies of PPM1D in breast cancer

Abstract

Vuosittain Suomessa todetaan noin 4000 uutta rintasyöpätapausta ja niinpä rintasyöpä onkin naisten yleisin syöpämuoto. Rintasyövän synty ja eteneminen aiheutuvat geenivirheistä, jotka johtavat muutoksiin geenien toiminnassa. Tärkeää osaa rintasyövän synnyssä näyttelevät ns. esi-syöpägeenit, jotka aktivoiduttuaan pystyvät muuttamaan normaalit solut syöpäsoluiksi. Geenivirheet voivat myös heikentää kasvua hillitsevien ns. kasvurajoitegeenien toimintaa. Tällaisia geenivirheitä kantava solu saattaa puolestaan saavuttaa kasvuedun ja alkaa jakautua normaalisoluja nopeammin.

Geenimonistuma on yksi merkittävimmistä mekanismeista, jonka avulla syöpäsolut aktivoivat kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen osallistuvia geenejä. Kromosomialue 17q23 on puolestaan yksi yleisemmin havaituista monistuneista alueista rintasyövässä ja tämän monistuman esiintymisen on myös osoitettu liittyvän kasvainten etenemiseen sekä potilaiden huonoon ennusteeseen. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä keskityttiin selvittämään 17q23 kromosomialueen monistuman vaikutuksia alueen geenien aktivoitumiseen rintasyöpäkasvaimissa. Tutkimus osoitti, että monistuman ydinalue rajautuu 1.56 Mb alueelle. Lisäksi tällä alueella sijaitsevien yhdentoista geenien toiminta oli kohonnut merkittävästi rintasyövässä vaikuttaen siten mahdollisesti ko. syövän kulkuun.

Toisessa osatyössä määritettiin yhden tällä alueella sijaitsevan geenin, PPM1D:n, liiallisen toiminnan merkitystä rintasyövässä. Tulokset osoittivat PPM1D-geenimonistuman 11 % rintasyöpäkasvaimia. Näissä kasvaimissa PPM1D-geenin toiminta oli myös kohonnut merkittävästi. PPM1D-geenimonistuman todettiin myös liittyvän ERBB2-proteiinin ilmentymiseen ja näin myös huonomman ennusteen kasvaimiin. Lisäksi PPM1D-geenin osoitettiin olevan tärkeä TP53- kasvurajoiteproteiinin toiminnan säätelijä, jolla on siten keskeinen rooli rintasyövässä. Samankaltainen analyysi paljasti PPM1D-geenimonistuman myös kuudessa (29 %) 21 rintasyöpäsolulinjasta. Tulokset osoittivat tämän monistuman johtavan PPM1D-geenin lisääntyneeseen toimintaan viidessä näistä rintasyöpäsolulinjasta.

Kolmannessa osatyössä PPM1D-geenin toiminnan merkitystä rintasyövässä tutkittiin hiljentämällä sen toimintaa käyttäen RNA interferenssi ­tekniikkaa. PPM1D-geenin toiminnan estäminen vähensi solujen kasvua sellaisissa solulinjoissa, joissa oli normaali TP53-kasvurajoitegeeni kun taas TP53-geenivirhettä kantavien solujen toiminnassa tällaista vaikutusta ei havaittu. Lisäksi tutkimus osoitti, että tämä solukasvun väheneminen johtui ainakin osittain ohjelmoidun solukuoleman eli apoptoosin lisääntymisestä.

RNA-interferenssi ­teknologiaa käytettiin myös tutkittaessa PPM1D-geenin hiljentämisen vaikutuksia geenien ilmentymistasoihin sekä solujen prosesseihin. PPM1D-geenin toiminnan estämisen jälkeen ihmisen genomin geenien ilmentymistasot analysoitiin geenisiruja käyttäen. Näin tunnistettiin 1798 geeniä, joiden ilmentyminen oli muuttunut. Näiden geenien tiedetään liittyvän keskeisiin solunsisäisiin prosesseihin, kuten solusyklin säätelyyn, useiden solunsisäisten rakenteiden ja osatekijöiden kokoonpanoon sekä signalointi- ja aineenvaihduntareittien säätelyyn. Tulokset osoittivatkin, että PPM1D-geeni osallistuu rintasyövän syntyyn vaikuttamalla useisiin tärkeisiin solunsisäisiin signalointireitteihin.

Yhteenvetona tutkimukset osoittavat, että monistuma 17q23 kromosomialueella johtaa useiden geenien ilmentymisen kasvuun rintasyövässä. Tällainen samanaikainen aktivaatio voi puolestaan olla mukana rintasyövän syntyprosessissa. Lisäksi tulokset korostavat yhden tämän 17q23 alueen geenin, PPM1D:n, keskeistä roolia rintasyövän kehittymisessä sekä etenemisessä. Tästä syystä PPM1D-geeniä voidaankin pitää yhtenä tärkeänä ehdokkaana kehitettäessä erilaisia uusia täsmäterapioita rintasyöpää vastaan.

Gene amplification is one of the major mechanisms allowing cancer cells to promote the expression of genes that are involved in tumor development and progression. At the same time, 17q23 is one of the most commonly amplified chromosomal regions in breast cancer and this amplification has also been shown to be associated with tumor progression and poor prognosis. The main objectives of this study were to fully characterize the molecular consequences of the 17q23 amplification on gene expression levels in primary breast tumors and also to define the functional significance of overexpression of PPM1D, one the genes residing in this region in breast cancer. To identify novel target genes at the 17q23 amplicon, a systematic gene expression survey using quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) on primary breast tumors with known 17q23 amplification status was performed. This study revealed a statistically significant (p To define the functional significance of PPM1D in breast cancer, RNA interference was used to inhibit PPM1D expression in BT-474, MCF7 and ZR-75-1 breast cancer cell lines harboring amplification and increased expression of PPM1D. Efficient downregulation of PPM1D resulted in significantly reduced cell proliferation in MCF7 and ZR-75-1 cells with wild-type p53 but not in BT-474 carrying mutant p53. Furthermore, the data indicated that the reduced cell growth observed after PPM1D silencing was at least partly due to increased apoptotic cell death. These findings suggest that PPM1D is involved in the regulation of cell proliferation in breast cancer in p53 dependent manner and that overexpression of PPM1D contributes to malignant phenotype by promoting sustained cell growth and cell survival.

To investigate the effects of PPM1D silencing on global gene expression patterns and signaling pathways, RNA interference (RNAi) was first utilized to downregulate PPM1D expression in BT-474, MCF7 and ZR-75-1 breast cancer cell lines and then oligonucleotide microarray analysis was performed. This way, altogether 1798 differentially expressed gene elements were identified. These genes were related to key cellular processes, such as regulation of cell cycle, assembly of various intracellular structures and components, and regulation of signaling pathways and metabolic cascades. These results suggest that PPM1D contributes to breast cancer associated phenotypic characteristics by directly or indirectly affecting several important cellular signaling pathways.

In conclusion, the findings of this study indicate that high level amplification of 17q23 in breast cancer leads to upregulation of multiple genes, suggesting that their concurrent activation may contribute to breast cancer. The results further emphasize the crucial role of one of the genes within the 17q23 amplicon, PPM1D, in the development and progression of breast cancer. Therefore, PPM1D may be considered as a candidate target for the development of specific molecular cancer therapies.