Structural studies of the membrane transport proteins Na,K-ATPase and melibiose permease by electron crystallography

Abstract

Kalvoproteiinit ovat tärkeitä solujen normaalille toiminnalle toimien kanavina, kuljetusproteiineina ja reseptoreina solukalvoilla. Ne ovatkin monien nykylääkkeiden vaikutuskohteita. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin kahden kalvokuljetusproteiinin rakennetta elektronikristallografian avulla. Proteiinit olivat eläinsoluissa natriumia aktiivisesti poistava ja kaliumia sisään kuljettava natrium-kaliumpumppu (Na,K-ATPaasi) ja sokereita kolibakteerin energianlähteeksi kuljettava melibioosipermeaasi (MelB).

Proteiinien toiminnan ymmärtämiseksi tulisi niiden kolmiulotteinen (3-D) rakenne tuntea. Rakenteen tunteminen auttaa myös proteiineihin spesifisesti kohdistuvien lääkkeiden kehittämistä. Valitettavasti kalvoproteiinien 3-D rakenteiden määritys on ollut ongelmallista, koska hydrofobisina niiden tuotannossa, eristämisessä ja kiteytyksessä on hankaluutensa. Elektronikristallografia soveltuu kalvoproteiinien rakennetutkimuksiin. Menetelmässä proteiinista valmistetaan kalvoympäristöön kaksiulotteisia (2-D) kiteitä, joita kuvataan läpäisyelektronimikroskoopilla alhaisessa lämpötilassa. Tietokoneohjelmia apuna käyttäen proteiinin rakenne voidaan lopulta selvittää kuviin sisältyvistä tiedoista. Parhaissa tapauksissa rakenteet pystytään selvittämään atomitasolle, mutta tämä edellyttää suurten ja hyvin järjestäytyneiden 2-D kiteiden aikaansaamista.

Suoritetut tutkimukset toivat uutta tietoa sekä Na,K-ATPaasin että MelB:n 3-D rakenteista, vaikkei atomitasoa saavutettu. Na,K-ATPaasin 3-D rakenne muistutti sukulaisproteiinin, sarkoplasmakalvoston Ca2+-ATPaasin rakennetta, koostuen kalvodomeenista ja kolmesta sytoplasmassa sijaitsevasta domeenista. Ca2+-ATPaasiin verrattuna Na,K-ATPaasi sisältää ylimääräisen beta-alayksikön ja lisäksi munuaisissa gamma-alayksikön, joiden sijainti pystyttiin määrittämään. MelB:n 3-D rakenne selvitettiin solun sisään avoinna olevassa konformaatiossa. Rakenne muodostui kahdesta toisiaan vasten olevasta domeenista koostuen todennäköisesti kahdestatoista alfa-kierteestä. Vertaus laktoosin kuljetusproteiinin selvitettyyn 3-D rakenteeseen osoitti yhteneväisyyksiä domeenien muodoissa ja proteiinin sisällä sijaitsevan kuljetuskanavan koossa, mutta paljasti selvän eron alfa-kierteiden järjestäytymisessä, joka oli MelB:ssä epäsymmetrinen. MelB:stä onnistuttiin valmistamaan 2-D kiteitä myös ilman melibioosi-substraattia. Näitä kiteitä voidaan käyttää sokerin sitoutuessa tapahtuvien rakenteellisten muutosten tutkimiseen.

Membrane proteins function as channels, transporters and receptors at cell membranes, exchanging ions, nutrients and material between cells and their surroundings. Membrane proteins are of central importance for normal cellular functions and their faulty operation causes diseases. Many of the present-day pharmaceuticals target membrane proteins. To better understand protein functions at the molecular level, it is essential to know their three-dimensional (3-D) structures. This is also helpful when specific drugs are designed. However, determining the 3-D structures of hydrophobic membrane proteins has been difficult due to problems with their overexpression, purification and crystallization. In this thesis electron crystallography was used for studying the structures of two membrane transport proteins: sodium and potassium transporting adenosine triphosphatase (Na,K-ATPase) from pig kidney and the sugar transporter melibiose permease (MelB) from Escherichia coli. The two transporters differ in their energy coupling since Na,K-ATPase is an active transporter that uses the hydrolysis of adenosine triphosphate in animal cells for pumping Na+ out of the cell and taking K+ in. This creates the Na+ gradient across the plasma membrane that is needed for regulating cell volume and driving other Na+ coupled transporters. On the other hand, MelB is a secondary transporter that couples to the existing favorable electrochemical gradient of Na+, Li+ or H+ ions for symport of sugar into the cell.

To study the 3-D structures, Na,K-ATPase and MelB were crystallized in two-dimensions into lipid bilayers, Na,K-ATPase in native membrane-bound form and MelB was purified and reconstituted. Images of crystalline areas were collected by cryo-electron microscopy and processed with image processing programs before the 3-D maps were calculated. The 3-D structure of Na,K-ATPase was determined in E2-conformation by using information to 8 Å resolution in the membrane plane. The structure is similar to the related sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase with a membrane domain and three cytoplasmic domains: the nucleotide-binding, actuator and phosphorylation domain. In comparison to Ca2+-ATPase, Na,K-ATPase contains two additional subunits. Positions of the Na,K-ATPase b-subunit and the FXYD-protein g-subunit, present in Na,K-ATPase in kidney membranes, could be determined from the 3-D map. The b-subunit is localized close to the transmembrane helices 8 and 10 of the a-subunit and the g-subunit in a groove surrounded by the a-subunit helices 2, 4, 6 and 9. The projection map of MelB was determined at 8 Å resolution and the 3-D structure at 10 Å resolution in the membrane plane. The structure shows two domains most likely composed of 12 transmembrane a-helices, in a conformation open towards the cytoplasm. Comparison to the 3-D structure of H+-coupled lactose permease shows similarities in the overall shape of the domains and the size of the internal cavity, where substrate transport takes place. However, MelB differs from lactose permease by having an asymmetrical helical organization. Two-dimensional crystals were also obtained without the substrate melibiose. These can be used for studying the structural changes taking place during substrate binding.

Taken together the present 3-D studies provide information about Na,K-ATPase and melibiose permease that is relevant for understanding their function at the molecular level.