Gene copy number alterations in prostate cancer

Abstract

Eturauhassyöpä on yleisin miesten syöpä Suomessa ja kolmannes kaikista miehillä diagnosoiduista syövistä on eturauhasesta lähtöisin. Vuosittain diagnosoidaan yli 4200 eturauhassyöpätapausta ja yli 740 miestä kuolee tautiin. Paikallisen eturauhassyövän hoitona on eturauhasen poisto, mutta levinnyttä syöpää hoidetaan hormonaalisella hoidolla. Hoito kuitenkin pettää lopulta yli 80%:ssa tapauksista ja syöpä muuttuu ns. hormonirefraktoriseksi, minkä jälkeen tehokasta hoitoa ei ole. Hormonirefraktorisista eturauhassyövistä löytyy usein kromosomialueiden monistumia, joiden kohdegeenejä ei yleensä tunneta. Syövän varhaisemmassa vaiheessa ilmaantuvat geenimonistumat saattavat puolestaan olla merkittäviä syövän aggressiivisuuden ilmaisijoita. Monistumien kohdegeenien tunnistaminen voisi johtaa uusien diagnostisten ja prognostisten menetelmien, sekä uusien hoitojen kehitykseen.

Väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin neljän (EIF3S3, MYC, HIF-1A ja EZH2) geenin kopiolukumuutoksia ja ennusteellista merkitystä eturauhassyövässä. HIF-1A-geenin kopiolukumuutokset olivat vähäisiä. Muiden geenien ylimääräisiä kopioita oli huomattavasti enemmän pitkälle edenneissä syövissä, jopa yli 50%:ssa hormonihoidon jälkeen uusiutuneista eturauhassyövistä. Lisäksi EIF3S3- ja EZH2- geenien monistumilla oli heikko yhteys lyhyempään tautivapaaseen aikaan leikkauksella hoidetuilla potilailla. EZH2-proteiinin ilmentyminen oli voimakkaampaa edenneissä syövissä, erityisesti sellaisissa, joissa oli geenin monistuma. EIF3S3-geenin monistuma näyttäisi myös olevan ennusteellinen tekijä sattumalta löydetyissä eturauhassyövissä. Näitä geenejä voidaan pitää kromosomialueidensa kopiolukumuutosten mahdollisina kohdegeeneinä.

Tutkimustarkoituksiin kehitetyistä eturauhassyöpämalleista (n=18) seulottiin koko genomin kattavasti geenien kopioluku- ja ilmentymismuutoksia cDNA-mikrosirujen avulla. Havaitut kopiolukumuutokset olivat enimmäkseen yhteneväisiä aikaisempien tutkimusten kanssa, mutta joidenkin muuttuneiden kromosomialueiden voitiin osoittaa olevan pienempiä tai koostuvan useasta erillisestä muutoksesta. Lisäksi löydettiin aiemmin tuntemattomia yleisiä kopiolukumuutoksia, kuten alueiden 1q21.2-23.1, 9p13-q21 ja 16p monistumat. Näillä alueilla sijaitsee useita geenejä, joiden ilmentymiseen kopioluvun muutoksella näyttäisi olevan vaikutusta ja niitä voidaankin pitää mahdollisina kohdegeeneinä, joiden tutkimuksia tulisi jatkaa. Yleisellä tasolla (koko genomin kattavasti) vähäinenkin kopioluvun muutos (+1-2 kopiota tai -1 kopio) näyttäisi vaikuttavan geenien ilmentymiseen merkittävästi.

Chromosomal aberrations, including deletions, gains and amplifications are thought to be a mechanism for the development and progression of cancer. Many frequent alterations have been described in prostate cancer, but only a few definitive target genes have been identified. The identification of target genes could lead to the development of diagnostic and/or prognostic markers as well as new targets for therapy. According to comparative genomic hybridisation (CGH), the HIF1A locus (14q23.2) is amplified in the prostate cancer cell line PC-3, and the EZH2 locus (7q36.1) in the prostate cancer xenograft LuCaP41. The locus of EIF3S3 (8q23.3­24.11) is gained in up to 80% of advanced prostate cancers. In order to determine whether these genes could be the target genes of the amplifications, fluorescence in situ hybridisation (FISH) was used to assess their amplification frequencies. In addition, the expression of EZH2 was studied by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Q-RT-PCR) and immunohistochemistry (IHC). No amplifications of HIF1A were found in clinical prostate cancer samples. Only PC-3 had an amplification of the gene, indicating that the generally observed overexpression of the protein in prostate cancer is not due to gene amplification. The frequencies of EIF3S3 and EZH2 gains/amplifications were significantly higher in advanced disease, reaching over 50% in hormone-refractory prostate cancer. The alterations were weakly associated with poor progression-free survival in prostatectomy-treated patients. The expression of EZH2 was higher in advanced disease and especially in samples with high-level amplification of the gene (p Finally, array comparative genomic hybridisation (aCGH) and cDNA microarrays were used to screen prostate cancer cell lines and xenografts for genome wide copy number and expression alterations. The copy number alterations (CNAs) and their frequencies were generally consistent with earlier data obtained by CGH of the same samples, although due to the better resolution some aberrations were narrowed down or shown to consist of several smaller aberrations interrupted by regions of normal copy number. Previously unreported frequent copy number alterations were also found, for example, gains in 1q21.2­23.1, 9p13­q21 and 16p. The amplicon in 9p13 was verified by FISH. cDNA microarrays showed that even a modest increase in copy number significantly affects the expression of the altered genes, indicating that simple gains may have a larger impact in prostate cancer than previously thought. Several putative target genes for copy number aberrations were also identified by cDNA microarray analysis, including POGZ (gain 1q21.3), ITGA4 (loss 2q31.3), FZD6 (gain 8q22.3), UBE2R2 (gain 9p13.3), and RBBP6 (gain 16p13.3). In conclusion, EIF3S3 and EZH2 may be considered putative target genes of the amplifications at 8q23­24 and 7q36.1, respectively. In addition, EIF3S3 could be used as prognostic marker. Array-CGH (aCGH) detects smaller regions of copy number alterations than CGH and may be used to narrow down known alterations and detect novel CNAs. When it is used together with expression arrays, putative target genes of the CNAs may be directly identified. Even a low-level copy number alteration appears to affect the expression of the altered genes.