Gene Amplification at 17q23 in breast cancer: Molecular Cytogetic and Microarray studies

Abstract

Rintasyöpä on naisten ylivoimaisesti yleisin syöpä Suomessa. Vuosittain Suomessa diagnosoidaan yli 3300 uutta rintasyöpätapausta. Rintasyövän syntyyn johtavat muutokset geenien toiminnassa. Suurin osa geenivirheista on elintapojen, ymparistötekijöiden ja vanhenemisen myötä syntyviä muutoksia rintarauhassolujen geenien rakenteessa ja toiminnassa. Valtaosa syövän geenimuutoksista ei ole periytyviä. Vasta pieni osa rintasyövän geenivirheistä on tunnistettu ja vielä vähemmän tunnetaan näiden geenivirheiden kliinistä merkitystä.

Ihmisen perimän emäsjärjestyksen selvittäminen (human genome program) on jättimäinen tiedeprojekti, jonka ensimmäinen vaihe valmistuu kesään 2000 mennessä. Tällöin opimme tuntemaan kaikki ne arviolta n. 150 000 geeniä, jotka säätelevat ihmisen kasvua, kehitystä, ja kaikkia solujen toimintoja. Ihmisgenomin kartoitus on ratkaisevasti muuttamassa biolääketieteellisen tutkimuksen mahdollisuuksia. Kaikkien geenien tunnistaminen on ensimmäinen vaihe, tämän jälkeen täytyy oppia ymmärtämään kunkin geenin biologinen merkitys, ja mahdollinen osuus tautien synnyssä. Käänteentekevä menetelmä tässä suhteessa on DNA-siruteknologia, jonka avulla kymmenien tuhansien geenien toiminta voidaan määrittää samanaikaisesti. Niinpä esim. syövässä poikkeavasti toimivat geenit voidaan tunnistaa jopa 10 000-kertaa aiempaa nopeammin. Jotta kertyvää valtavaa tietomäärää voitaisiin nopeasti hyödyntää kliinisten sovellutusten tutkimuksessa, tarvitaan myös soveltavan ja kliinisen tutkimuksen puolella uusia m! enetelmiä ja lähestymistapoja.

Tässä tutkimuksessa kehitimme uuden menetelmän, kudossiruteknologian, joka mahdollistaa tuhansien potilasnäytteiden analysoinnin samanaikaisesti ja nopeasti. DNA-siru ja kudossirutekniikat ovat ratkaisevasti nopeuttaneet geenilöydösten ja niiden kliinisen merkityksen tutkimusta. Tätä tutkimusstrategiaa sovelsimme menestyksellisesti uuden rintasyövässä aktivoituvan geenin, ribosomaalisen S6 kinaasin (S6K) löytämiseen, ja sen kliinisen merkityksen tutkimukseen. Potilailla, joilla todettiin S6K geenin aktivoituminen, oli selkeästi muita huonompi ennuste. Tutkimuksessa tunnistettiin myos useita muita rintasyövän syntyyn ja leviämiseen liittyviä geenejä. Uusien syöpägeenien tunnistaminen on ensiarvoisen tärkeää taudin syntymekanismien ymmärtämiseksi sekä diagnostisten ja hoitovastetta ennakoivien laboratoriotestien kehittämiseksi. Syöpä- ja normaalikudoksen väliset erot geenien toiminnassa muodostavat myös lähtökohdan uusien syöpälääkkeiden kehittämiselle. Tässä tutkimuksessa saadut tulokset saattavat siten tulevaisuudessa parantaa rintasyöpäpotilaiden hoidon suunnittelua, hoidon toteutusta ja sen tehon arviointia.

Cancer is a disease that results from a series of molecular genetic events involving activation of oncogenes, inactivation of tumor-suppressor genes and dysfunction of proteins encoded by genes involved in DNA repair and maintenance of genomic stability. In breast cancer, the predominant mechanism of oncogene activation is gene amplification. Studies by comparative genomic hybridization have shown that chromosomal region 17q22-q24 is one of the most often amplified chromosomal regions in breast cancer. However, no currently known oncogenes are located at 17q22-q24 suggesting that this region may harbor previously unknown genes that are important in breast cancer progression.

The aim of this study was to develop and apply molecular cytogenetic genome scanning and microarray techniques for the characterization of the 17q22-q24 amplification in breast cancer as well as to analyze its clinical significance. As an initial characterization of the 17q22-24 amplification, copy number profiles along 17q were constructed using fluorescence in situ hybridization (FISH) with physically mapped 17q probes. FISH showed that at least two separate regions at 17q23 undergo high-level amplification in breast cancer. The distal region was amplified independently of ERBB2 and was chosen for further study. An approximately 4 megabase (Mb) contig containing 64 large insert size clones and 77 STSs was constructed. 101 transcripts and 6 known genes (RAD51C, S6K, PAT1, NACA, SIGMA1B and TBX2) were mapped to this region. Four of them (RAD51C, S6K, PAT1, and TBX2) were shown to be highly amplified and overexpressed in breast cancer cell lines, indicating that they might have a role as a target for the 17q23 amplification.

Simultaneous screening of expression levels of 4209 genes by cDNA microarrays in cell lines with high-level amplification at 17q23 identified the ribosomal protein S6 kinase (S6K) as the most highly upregulated gene of all the genes tested. S6K was systematically overexpressed in all 17q23 amplified breast cancer cell lines. It codes for a critical regulator of G1 to S-phase transition and therefore represents an attractive target gene to be amplified in breast cancer. In addition, RT-PCR screening of transcripts mapped to the amplified region at 17q23 pinpointed a highly overexpressed EST. The corresponding gene (MB1) was cloned, and sequence analysis showed no homology to any other genes.

A new high-throughput method, tumor tissue microarray ("tissue chip") was developed to facilitate rapid molecular profiling of very large numbers of specimens in a single experiment. Tissue microarrays are constructed by bringing minute cylindrical tissue samples (diameter 0.6 mm) from hundreds of different tumors into a single paraffin block in an array format. Sections cut from this tissue microarray block can then be applied in the analysis of molecular alterations at the DNA, RNA or protein level, using e.g. in situ hybridization or immunohistochemistry. To investigate the involvement of the amplified and overexpressed genes in vivo, FISH analysis of a tissue microarray containing 372 primary breast cancers was used. S6K, PAT1, and TBX2 were often co-amplified and involved in about 10% of tumors, whereas RAD51C amplification was only seen in 3% of the tumors. The clinical significance of S6K amplification was studied using a tissue array for which prognostic information on the patients was available. A clear association between amplification and poor prognosis of the patients was observed (p=0.002). The fact that S6K, PAT1, and TBX2 were frequently co-amplified suggests that similar prognostic association could be observed with the other genes as well. Furthermore, co-amplification of S6K and ERBB2 genes implied a particularly poor survival. In summary, our findings indicate that the frequent amplification of 17q23 in breast cancer leads to upregulation of multiple genes (RAD51C, S6K, PAT1, TBX2 and novel gene MB1) suggesting that their simultaneous activation may contribute to the initiation and progression of breast cancer. These genes represent candidate targets for specific molecular therapies.