Regulation of Cytokine Signaling During Macrophage Differentiation and Activation

Abstract

Sytokiinit ovat elimistön liukoisia välittäjäaineita. Sytokiinit säätelevät solujen toimintaa, kuten kasvua, erilaistumista ja solukuolemaa, solujen pinnalla ilmennettävien reseptoreiden kautta. Reseptoreiden aktivaatio johtaa muutoksiin solunsisäisten signalointireittien toiminnassa, joka puolestaan johtaa muutoksiin geenien ilmentymisessä.

Makrofagit ovat tärkeitä, immuunivastetta sääteleviä soluja. Tutkimuksessa selvitettiin tarkemmin makrofagien erilaistumisen ja aktivaation vaikutuksia solunsisäisten signalointireittien säätelyyn. Interleukiini-3 (IL-3) on tärkeä kasvutekijä makrofagien kypsymättömille esiasteille. IL-3 aktivoi solunsisäisen JAK tyrosiinkinaasiperheen jäseniä, ja nämä puolestaan aktivoivat geeniluentaan vaikuttavia STAT transkriptiotekijöitä. Tutkimuksessa osoitettiin, että IL-3 välitteinen signalointi sammutetaan osittain makrofagien erilaistumisen aikana. Mekanismin osoitettiin johtuvan erään seriini/treoniinikinaasi-perheen jäsenen - Proteiini kinaasi C:n (PKC) ­ aktivoitumisesta farmakologisesti aiheutetun makrofagierilaistumisen aikana.

Jatkotyössä tutkittiin tarkemmin erilaistumisen aiheuttamaa signalointia makrofagien esiasteissa. Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) on kasvutekijä joka aiheuttaa makrofagierilaistumista ja jonka on osoitettu aktivoivan PKC perhettä, mutta aiemmin ei ole tutkittu mitä PKC perheen jäseniä M-CSF aktivoi. Tutkimuksessa osoitettiin että M-CSF aktivoi nopeasti PKC-δ isoformin PKC perheestä. Lisäksi osoitettiin, että PKC-δ aktivaatio johtaa hiirisolumallissa uuden vähän tunnetun geenin (Pkare) ilmentymisen lisääntymiseen. Pkare:n vastingeenin ihmisessä (PRKX) on aiemmin osoitettu olevan tärkeä tekijä makrofagien erilaistumisessa.

Tärkeä makrofagien aktivoitumista säätelevä tekijä on Interferoni-gamma (IFN-γ). IFN-γ reseptori aktivoi solunsisäisesti JAK1 ja JAK2 tyrosiinkinaasit ja nämä puolestaan aktivoivat STAT1 transkriptiotekijän. Toinen makrofagiaktiivisuutta lisäävä tekijä ovat B-solujen erittämät immunoglobuliinit (Ig), joilla on oma reseptori makrofagien pinnalla. Tutkimuksessa havaittiin, että immunoglobuliiniresptori aiheutti PKC-δ kinaasin aktivaation ja IFN-γ signaloinnin eston. PKC-δ:n tärkeää roolia IFN-γ signaloinnin säätelyssä tuki havainto, että mikäli PKC-δ kinaasi puuttui soluista kokonaan, IFN-γ signalointi oli jonkin verran vahvistunut.

Ubikitinisaatio on mekanismi, joissa soluihin liitetään ubi-proteiineja, ikään kuin osoitelapuiksi, jotka ohjaavat proteiinin solunsisäiseen hajotukseen. Sekä IL-3:n että IFN-γ:n osoitettiin ubikitinisoivan Jak2 kinaasia, ubikitinisaation toimiessa näiden signaalinvälitysreittien negatiivisena säätelijänä.

Sytokiinien negatiivisen säätelyn tunteminen on tärkeää, jotta mahdollisiin säätelyvirheisiin voitaisiin terapeuttisesti puuttua. Tutkimuksessa on kuvattu erilaisia IL-3 ja IFN-γ signaloinnin toimintaa estäviä solunsisäisiä mekanismeja, jotka tuovat toimintamahdollisuuksia tulevaisuuden lääkekehitystyölle.

Hematopoietic cytokines regulate the differentiation and growth of blood progenitor cells in bone marrow. As hydrophilic substances, cytokines cannot penetrate the cell membrane, but they use specific transmembrane receptors to transmit information from extracellular space into cells. The binding of a given cytokine into a corresponding transmembrane receptor triggers the specific activation of several intracellular signaling pathways.

Macrophages have an important role in regulating immune responses through phagocytosis and by expressing both pro- and anti-inflammatory cytokines. Macrophage development from an undifferentiated precursor cell into a fully active effector cell of innate immunity requires several steps of differentiation, activation and proliferation. Most of these cellular functions are tightly regulated by hematopoietic cytokines. This study was aimed at characterizing the changes in cytokine signaling - especially the negative regulation of signaling - during macrophage differentiation and activation.

An important cytokine for the proliferation of early myeloid precursor cells is interleukin-3 (IL-3). Binding of IL-3 to its cognate receptor on the cell surface leads to the activation of Janus kinase 2 (named after Janus, the ancient Roman god of gates and doorways who was termed Janus; hence Jak) and the subsequent activation of the Signal Transducer and Activator of Transcription 5 (Stat5) transcription factor. IL-3-induced Jak2/Stat5 activation promotes cell proliferation. During macrophage differentiation the IL-3-induced tyrosine phosphorylation of several intracellular proteins including both IL-3 receptor β-chain (IL-3Rβ) and Jak2 was inhibited in murine myeloid progenitor 32D cells. Differentiation in these cells was induced by the activation of ectopically expressed Protein kinase C (PKC)-α and -δ isoforms. PKC-δ is a serine/threonine kinase, whose kinase activity was required for Jak2 inhibition. It was observed that PKC-δ induced both serine and threonine phosphorylation of Jak2.

A key cytokine regulating macrophage activity is Interferon (IFN)-γ. IFN-γ is an important activator of monocytes and macrophages and it also regulates immunoglobulin class switch in B-cells and Th1 differentiation from naïve Th0 cells. IFN-γ receptor activation induces the activation of Jak1/Jak2 and Stat1. To study whether PKC-δ-mediated Jak2 inhibition was utilized during macrophage activation, IFN-γ-induced signaling was investigated. IFN-γ-induced Jak2 activation was inhibited by PKC-α and -δ isoforms in human promyelocytic HL-60 and THP-1 cells. In addition, human monocytes demonstrated decreased IFN-γ responsiveness upon PKC activation. As in the case of the IL-3 receptor, inhibition of IFN-γ signaling required the kinase activity of PKC-δ.

To study the role of PKC-δ in physiological signaling cascades leading to macrophage differentiation, the signaling of Macrophage-Colony Stimulating Factor (M-CSF), a cytokine that induces macrophage differentiation, was studied. M-CSF rapidly increased PKC-δ activity. In addition, Fcγ-receptor (FcγR), an activating macrophage receptor induced PKC-δ activity. M-CSF-induced differentiation corresponded to the rapid activation of PKC-δ, resulting in the increased expression of Protein kinase A related kinase (Pkare), a murine homologue of the novel human kinase, Protein Kinase X (PRKX), whose expression is associated with macrophage differentiation.

An important mechanism for the negative regulation of cytokine signaling is polyubiquitination. Protein degradation mediated by polyubiquitination is characterized by the ligation of ubiquitin proteins into target proteins which results in the degradation of the targets in 26 proteasomes, large multicatalytic proteases. An additional mechanism for down-regulating cytokine-induced Jak2 responses was found to be the ubiquitination and proteosomal degradation of tyrosine phosphorylated Jak2. In addition to the tyrosine phosphorylation of Jak2, ubiquitination involved suppressor of cytokine signaling1 (SOCS1).

Both ubiquitination and PKC-δ-mediated inhibition of Jak2 appear to represent mechanisms of the fine-tuning of cytokine signaling.